大鼠Kruppel样因子14腺病毒载体的构建及其对心肌细胞肥大的影响

任志磊 杨崇哲 银孟卓 黄凯华 刘丰

广州医科大学附属广州市第一人民医院老年病科（广州510180）

肥胖及脂肪组织与心血管疾病密切相关。作为内分泌器官，脂肪组织分泌脂联素（adiponectin）、趋化素（chemerin）、瘦素（leptin）等脂肪因子实现与心脏组织的对话。然而各种脂肪因子对心脏的作用并不一致甚至相反［1-3］，因此整体把握脂肪因子网络对心血管的影响，是探索脂肪内分泌途径治疗的前提。

Kruppel样转录因子（kruppel-like factors，KLFs）广泛参与细胞增殖、凋亡、分化、胚胎发育及脂肪细胞分化调控［4］。Kruppel 样因子14（kruppellikefactor 14，KLF14）属于KLFs 家族，是脂肪细胞内其他基因的“主控调节”基因［5］。CIVELEK等［6］和VOIGHT 等［7］证 实KLF14 基因作为远端基因的“总开关”控制着一系列代谢性特征相关基因的下游基因。然而，KLF14 是否通过整体调控脂肪因子网络影响心肌肥厚等心血管疾病目前尚未明确。本研究构建大鼠KLF14 腺病毒表达载体，感染心肌细胞后使KLF14 在心肌细胞内过表达，研究KLF14 对心肌细胞肥大的影响，为探索心肌肥厚有效干预靶点提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 质粒、细胞与菌株人胚肾细胞系HEK293细胞、LipofiterTM 转染试剂从上海汉恒生物公司购买，pHBAd-MCMV-RFP 载体从Hanbio 公司购买，大肠杆菌菌株DH5α从Tiangen 公司购买。

1.1.2 动物与试剂出生1～3 d 的SPF 级SD 大鼠乳鼠购自中山大学实验动物中心（许可证号SCXK（粤）2011-0029，合格证号：NO.44008500004729）。限制性内切酶、T4 DNA 连接酶和DNA ladder 从Fermentas 公司购买，质粒抽提试剂盒从康为世纪公司购买，凝胶回收试剂盒从Axygen 公司购买。DMEM、胎牛血清、胰酶从Gibco 公司购买。CCK-8细胞毒性检测试剂盒从上海贝博公司购买。

1.2 新生大鼠心肌细胞原代培养用0.06%胰蛋白酶分离出生1～3 d 的SD 大鼠乳鼠心室肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes，NRVM）。采用差速贴壁法纯化细胞。在最初培养的48 h，在细胞培养基中加入0.1 mmol/L BRDU抑制成纤维细胞增殖，72 h 后用于实验。用浓度为10 μmol/L 异丙肾上腺素（isoprenaline，ISO）刺激诱导NRVM 建立心肌细胞肥大模型。设立对照组（无菌生理盐水）及6、12、24、48、72 h 等不同时间的ISO 刺激组。原代培养NRVM，设KLF14 腺病毒（adenovirus-KLF14，Ad-KLF14）组、ISO+Ad-KLF14 组、RFP 腺病毒（adenovirus-red fluorescent protein，Ad-RFP）组、ISO+Ad-RFP 组共4 组，实时定量PCR（real-time PCR，RTPCR）检测各组KLF14 及B 型钠尿肽（BNP）mRNA的表达情况。

1.3 KLF14 腺病毒表达载体的构建过程

1.3.1 重组质粒制备根据在NCBI 查询到的大鼠KLF14 基因序列人工合成KLF14 基因组片段。用配制好的BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切体系处理pHBAd-MCMV-RFP 载体和KLF14 基因组片段。取2 μL 回收的酶切后KLF14 片段、100 ～200 ng 回收的酶切后pHBAd-MCMV-RFP 载体、1 μL T4 DNA连接酶、2 μL DNA 连接酶缓冲液，加灭菌双蒸水至20 μL 配成连接液反应体系。该反应体系在16 ℃过夜后即得到pHBAd-MCMV-RFP-KLF14 重组质粒。PCR 鉴定并测序重组质粒，然后通过大肠杆菌大量扩增。

1.3.2 腺病毒载体包装与纯化在293 细胞中把pHBAd-MCMV-RFP-KLF14 重组质粒、pHBAd-BHG骨架质粒包装成pHBAd-MCMV-RFP-KLF14腺病毒后扩增，收获腺病毒并测定Ad-RFP和Ad-KLF14 滴度，分装后-80 ℃保存备用。

1.3.3 腺病毒滴度测定待培养的HEK293 细胞生长密度约90%时消化细胞，计数后用含有5%胎牛血清的DMEM 培养液稀释HEK293 细胞至1 ×105/mL，100 μL/孔加入96 孔板（1 × 104细胞/孔）。将10 μL 病毒上清液按梯度稀释10 ～106倍，取稀释后的病毒液依次加到细胞孔中，100 μL/孔，每个病毒准备6 个复孔。继续培养24 h 后，每孔更换100 μL 新鲜培养液，72 h 后观察并计算滴度，滴度（PFU/mL）=表达RFP 阳性细胞数×稀释倍数/病毒体积。

1.4 腺病毒感染心肌细胞流式检测培养NRVM后换用不含血清的DMEM 培养基培养24 h，加入腺病毒，设置对照组（加DMEM 培养基）和感染倍数（multiplicity of infections，MOI）分别为5、10、20、50、100 梯度组的Ad-KLF14 或Ad-RFP，轻摇细胞培养板混匀，37 ℃，5%CO2培养2 h，置于荧光显微镜下拍照。吸取培养基，PBS 洗2 次后用胰酶消化NRVM，NRVM 刚变圆时立即终止消化。离心后用1 mL PBS 重悬NRVM，流式细胞仪检测NRVM 感染率。

1.5 CCK-8 法检测不同MOI 腺病毒感染时心肌细胞活力原代培养NRVM，分为以下6 组：对照组（给予DMEM）、Ad-RFP MOI 5 和20 感染组、Ad-KLF14MOI 5、20 和50 感染组，同时设立无细胞的空白孔。每组设定10 个复孔。NRVM 活力（%）=（实验NRVM 孔OD-空白孔OD）/（对照NRVM 孔OD-空白孔OD）×100%。

1.6 RT-PCR 检测KLF14 和BNP 表达从各组NRVM 提取RNA行RT-PCR，内参GAPDH 引物为5-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3 和5-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3；KLF14 引 物 为5-TACCGCAGGAGGCAGATTAC-3 和5-TACGCTGGTGTGACTTGAGG-3；BNP 引物为5-GAGACAAGAGAGAGCAGGACAC-3和5-AAGCAGGAGCAGAATCATCT-3。实验重复3 次，以Ad-RFP 感染的NRVM 为对照，2-△△Ct法计算各组间相对表达量。

1.7 统计学方法使用SPSS 19.0 软件对实验数据进行统计学分析，实验结果用均数±标准差表示。多组间比较使用方差分析，两组间比较使用独立样本t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ISO 刺激心肌细胞肥大上调KLF14 表达用10 μmol/L 的ISO 刺激体外培养NRVM，以无菌生理盐水处理的NRVM 作阴性对照组，RT-PCR 检测不同刺激时间点KLF14 的mRNA 表达水平。结果显示，NRVM 内KLF14 在生理状态下低丰度表达，ISO刺激30 min时即出现明显升高，4 h时升高最明显，随着刺激时间延长，表达量逐渐恢复至正常低水平，至24 h与对照组差异无统计学意义。见图1。

2.2 KLF14 腺病毒载体构建

2.2.1 pHBAd-MCMV-RFP-KLF14 重组载体构建后的酶切鉴定及测序腺病毒骨架及pHBAd-MCMV-RFP 表达载体图谱见图2。该表达载体中含有CMV 启动子调控的红色荧光蛋白基因表达。PCR 扩增KLF14 目的基因片段，插入MCMV 启动子后多克隆位点区的BamH I/EcoR I 位点，构建表达质粒pHBAd-MCMV-RFP-KLF14。扩增电泳后回收载体胶，pUC57-KLF14 双酶切结果、KLF14 单克隆PCR 鉴定结果见图3。经上海桑尼生物技术有限公司测序证实插入序列和腺病毒模板质粒100%吻合。和GenBank 已知序列进行BLAST 比对分析证实序列同源性100%相同，说明腺病毒重组质粒构建成功，见图4。

图1 ISO 不同刺激时间KLF14mRNA 相对表达水平Fig.1 KLF14 mRNA expression was upregulated in NRVM under ISO stimulation

图2 腺病毒大骨架和pHBAd-MCMV-RFP 表达载体图谱Fig.2 The structures of adenovirus vector and pHBAd-MCMV-RFP

图3 腺病毒构建过程中相关电泳结果Fig.3 The electrophoresis photos of enzyme-digested adenovirus vector

2.2.2 腺病毒滴度测定Ad-RFP 和Ad-KLF14 感染293 细胞得到的第一、二、三代病毒中，均能在荧光显微镜下观察到明显的红色荧光，提示构建的腺病毒载体能够良好的表达KLF14 蛋白。改进的TCID50法计算构建的Ad-RFP滴度2×1010PFU/mL，Ad-KLF14 滴度1×1010PFU/mL。

2.2.3 腺病毒感染心肌细胞MOI 的选择离体培养的NRVM 培养基中加入腺病毒2 h 后，根据感染和未感染腺病毒的心肌细胞对光散射率不同，应用流式细胞仪测定心肌细胞感染率，随着腺病毒MOI 增加，心肌细胞感染率升高，见图5、6。腺病毒感染心肌细胞后对细胞有一定的毒性作用，CCK-8 检测结果见图7。RFP 腺病毒MOI 为5 和20时心肌细胞活力无明显差异，Ad-KLF14MOI 超过5 时，随着MOI 的升高，心肌细胞活力逐渐降低。由于Ad-KLF14 感染率较Ad-RFP 感染率低，综合考虑腺病毒感染心肌细胞的感染率、腺病毒的毒力和心肌细胞活力，后续实验选择感染NRVM 的Ad-KLF14MOI 为20，Ad-RFP 的MOI 为10。

图4 测序结果对比图Fig.4 Comparision of sequencing results

图5 流式细胞仪检测不同MOI 腺病毒感染心肌细胞感染率Fig.5 The infection rates of NRVM by different MOI of KLF14 or RFP adenovirus detected by FACS

图6 不同MOI 腺病毒感染心肌细胞感染率直方图Fig.6 The infection rates of NRVM by different MOI of KLF14 or RFP adenovirus detected by FACS（histogram）

图7 CCK-8 检测腺病毒不同MOI 感染心肌细胞时细胞活力比较Fig.7 Comparison of NRVM viability by different MOI KLF14 or RFP adenovirus detected by CCK-8 assay

2.3 KLF14过表达促进ISO诱导的心肌细胞肥大BNP 主要在心室肌中合成，广泛应用于心力衰竭等心血管疾病的诊断、治疗及预后评估，是判断心肌细胞肥大的重要指标［8-10］。为进一步明确KLF14 在心机细胞内高表达对细胞肥大的作用，用Ad-KLF14或Ad-RFP 感染NRVM 后，ISO 刺激细胞产生肥大，以无菌生理盐水作为空白处理对照，RT-PCR 检测不同处理组心肌细胞BNP 的表达水平。如图8 所示，无论是Ad-KLF14 组还是Ad-RFP 组，腺病毒联合ISO 组较单纯腺病毒组BNP mRNA 都明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；单纯感染Ad-KLF14较单纯感染Ad-RFP 组BNP mRNA 差异无统计学意义。Ad-KLF14 联合ISO 组较Ad-RFP 联合ISO 组BNP mRNA明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05），提示KLF14 在心肌细胞内过度表达进一步加重细胞肥大。

3 讨论

图8 不同处理组BNP mRNA 相对表达水平直方图Fig.8 KLF14 overexpression promotes upregulaion of BNP in ISO-induced hypertrophic NRVM

KLF14在心血管疾病中的研究主要集中在动脉粥样硬化方面［11］。有研究［12］显示，激活KLF14 可通过调节ApoA-I产生减轻动脉粥样硬化，在急慢性炎症状态下，血管内皮KLF14 表达下降，KLF14 可通过抑制NF-κB 信号通路减轻血管炎症［13］。但WEI 等［14］的研究认为下调KLF14 表达降低高脂饮食喂养的ApoE-KO小鼠循环中促炎细胞因子水平，抑制动脉粥样硬化病变的形成，可能与其调节p38mapk 和ERK1/2 信号通路有关。

目前KLF14在心肌肥厚中的研究尚未见报道。心肌肥厚是心脏对慢性压力或容量超负荷产生的代偿反应，见于高血压心脏病、肺动脉高压等疾病，其中最常见的是高血压病引起的左室肥厚（LVH）［15］，心肌细胞肥大是心肌肥厚的基本病理形式。ISO 刺激心肌细胞能较好模拟病理性肥大过程，是目前公认的心肌细胞肥大模型之一。本研究首次发现，KLF14 在NRVM 中低丰度表达，在病理性肥大NRVM 中表达上调，提示KLF14 在病理性肥大中可能发挥作用。由此进一步构建了细胞感染率较高的KLF14 腺病毒载体，首次研究了KLF14 在心肌细胞中的作用，确定KLF14 腺病毒感染NRVM 过表达KLF14 可以促进ISO 诱导的心肌细胞肥大，提示干预KLF14 及其下游通路可能是改善病理性心肌肥厚的潜在治疗靶点。但这一作用尚需在整体动物模型上验证，其相关分子机制亦需进一步深入研究。此外，KLF14 是多种脂肪因子的“主控调节”基因，心肌细胞亦可表达甚至分泌多种脂肪因子，KLF14 是否通过调控脂肪因子网络影响心肌肥厚等心血管疾病，目前尚不清楚，还需要进一步研究。

综上，生理情况下，KLF14 在心肌细胞中低丰度表达，KLF14 在ISO 刺激诱导的肥大的NRVM 中表达明显上调。本研究成功构建KLF14 腺病毒载体，感染NRVM 后过表达KLF14 促进NRVM 病理性肥大。这一发现为KLF14 在心肌肥厚中的进一步作用研究提供初步线索和理论基础，为探索有效干预靶点提供新的思路。