骨髓间充质干细胞治疗阿尔兹海默病模型小鼠研究进展

路亚岚石桂英王克维白 琳

(中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021)

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD),又称老年痴呆症,是一种原发性中枢神经系统退行性疾病。 AD 是一种慢性疾病,患者处于无外显症状的临床前期时间约8~10 年,65 岁以上老人发病率约1%~3%[1]。 AD 的发病率随年龄增长呈逐渐上升趋势,据报道,70 岁以后年龄每增加5 岁,AD 的危险性随之增加1 倍[2]。 流行病学资料显示,我国AD 患者人数已超过800 万,约占全球的的1/5[3]。随着我国人口老龄化程度的加剧,AD 成为继心血管疾病、肿瘤和脑卒中之后的第4 位杀手。 AD 的主要临床表现包括渐进性记忆障碍、失语、失用、失认、执行功能障碍以及人格和行为改变,并伴随有一系列精神病症状[4]。 随着病情呈进行性加重,后期患者几乎无法正常思考和判断,生活不能自理。确诊AD 后,男性患者平均生存时间约4.2 年,女性患者约5.7 年[5]。 AD 的发生给患者及其家庭和社会带来了巨大的身心痛苦和经济负担[6]。

AD 发病机理复杂,其神经病理学特征,主要包括老年斑、神经原纤维缠结以及神经元和突触的丢失[7]。 老年斑以细胞外沉积的 β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)为核心,周围是受损的轴突和树突以及胶质细胞;神经原纤维缠结是由过度磷酸化的Tau 蛋白沉积所致,其主要聚集在神经元胞内,此外也可在树突和轴突聚集,分别形成纤维网线和老年斑炎冠。 AD 患者常常伴随着神经元和突触的丢失,多见于颞顶叶和额叶及扣带回部位[8-9]。这些病理特征导致脑神经元结构异常、神经网络破坏和神经元信息交流障碍,是AD 患者认知记忆功能障碍和精神行为异常的主要原因。

目前,AD 治疗以胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)拮抗剂为主[10]。 前者主要通过降低乙酰胆碱的水解速度从而提高其在患者体内的含量,后者通过抑制AD 患者过度激活的NMDA 受体、减少神经元凋亡来发挥作用。 它们可维持退化的神经元功能,但无再生修复功能,因此对于早期AD 患者的疗效较好,但中晚期患者收效甚微,而且这些药物治疗并不能阻断AD 病程进展。 到目前为止,确诊的AD 患者往往为中后期,且常伴随多种代谢疾病,可用治疗方法非常有限。 此外,中草药物和针灸对AD 患者的临床症状也有不同程度的缓解,主要通过调理机体代谢和营养神经达到缓解症状的效果,但对AD 的治疗并无针对性,且个体间疗效差异较大[11-12]。 因此,进一步研究AD 的新治疗方法是临床急需攻关的重大问题。

1 BM-MSCs 治疗AD 模型小鼠的细胞和动物模型概述

1.1 骨髓间充质干细胞特征

间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)来源于中胚层,具有自我更新和多向分化潜能,且其免疫源性低,在再生医学治疗中作为“种子”细胞,是治疗AD 的新型方法[13]。 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSCs)来源于骨髓基质干细胞,作为最早被发现的MSCs,是探讨 MSCs 应用研究的“金标准”[14]。 BM-MSCs 分离操作简单,可体外培养;它的免疫源性低,可异体移植,在动物体内长期存活;而且它的应用符合伦理要求,是干细胞治疗中的理想选择[4]。

进一步深入研究发现BM-MSCs 具有归巢性,移植后可转移至损伤和炎症部位,它不仅能向骨、软骨和脂肪组织分化,还能在特定条件下分化为神经样细胞,可补充和替代已退化的神经元,因此具有神经元再生潜能。 近年来,研究显示BM-MSCs 不仅可以激活小胶质细胞、促进吞噬 Aβ 蛋白并释放Aβ降解酶以减少老年斑沉积,而且还可以通过促进细胞自噬功能,增强对Aβ 蛋白的清除以延缓AD 的进展[15]。 此外,BM-MSCs 可分泌多种生长因子和抗炎因子,诱导血管生成和神经发生,增加突触连接,调节免疫微环境,减少神经元凋亡,维持神经元活性[16]。 因此,BM-MSCs 不仅可预防/治疗早期患者,对中晚期患者的治疗也有广阔的应用前景。

1.2 BM-MSCs 治疗常用的AD 模型动物

目前,细胞移植治疗中常用的AD 模型动物主要模拟淀粉样变性的病理特征,分为Aβ 诱导的AD模型动物和遗传修饰的模型动物两类。 Aβ 是老年斑的主要成分,在海马/脑室注射聚集态Aβ(Aβ1-42,Aβ1-40,Aβ25-35)片段可导致神经元凋亡,引起胶质细胞增生的炎症反应进而产生淀粉样变性,模拟老年斑的病理现象,形成学习记忆能力衰退的AD 动物模型[17]。 该种造模方法操作简单,造模成功率高、稳定性好且耗时短,不仅可用于小鼠,也可以用于大鼠模型构建。 然而该方法在注射的过程中会难以避免造成脑组织穿透性机械损伤,造成不可预知的神经功能受损。

细胞移植治疗中常用的遗传修饰的动物模型为针对淀粉样前蛋白(amyloid precursor protein,APP)、早老素1(presenilin-1, PS1)和相关基因突变体构建的多重转基因小鼠模型。 APPswe/PS1dE9(APPK670N,M671LPSEN1ΔE9, APP/PS1)双转小鼠是最常用的遗传修饰AD 小鼠模型,该双转小鼠表达突变的APP 和PS1 融合体,4 月龄时皮层与海马产生淀粉样蛋白沉淀,7 月龄水迷宫实验中可检测到认知记忆功能障碍;三转小鼠模型3×Tg(APPK670N,M671LPSEN1M146VMAPTP301L),6 月龄时皮层与海马有弥散分布地坚实淀粉样蛋白沉积,6 月龄时通过水迷宫可观察到认知功能障碍;5×FAD(APPK670N,M671LAPPV717IAPPV716VPSEN1M146LPSEN1L286V)小鼠是携带5 个家族性基因突变的APP/PS1 的AD 转基因小鼠,该种小鼠从2 个月起皮层即出现老年斑沉积,并随着月龄逐渐增加,4~5 月龄时通过Y 迷宫可观察到认知功能障碍[18]。 迄今为止,尚未发现能够完全模拟AD 的病理进程的动物模型。 因此,在具体的科学实践中应根据实验需求和条件来选择合适的实验动物模型[19]。

2 BM-MSCs 治疗AD 模型小鼠的效果、机理及其特点

2.1 BM-MSCs 直接移植治疗AD 动物模型

BM-MSCs 直接移植治疗AD 动物模型,通过水迷宫实验发现BM-MSCs 治疗组小鼠的潜伏期缩短、穿台次数增加,空间学习记忆能力增强,并接近对照野生型(wild type, WT)小鼠水平[20-21]。 结果显示,BM-MSCs 可向损伤部位迁移,治疗组小鼠皮层和海马的淀粉样蛋白沉积减少,进一步分析发现Aβ降解酶增加,例如脑啡肽酶(neprilysin),Aβ 周围小胶质细胞数量增加,海马内新生血管数量增加,它们可促进Aβ 的降解和转运。 同时,BM-MSCs 减少APP/PS1 小鼠脑内Tau 蛋白的磷酸化水平[22-23]。也有研究发现BM-MSCs 可调控微环境的免疫活性,Lee 等[24]发现BM-MSCs 可抑制小胶质细胞的过度激活,其中炎症因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α, TNFα),白细胞介素 1β(interleukin 1β,IL1β)表达降低,抗炎因子白细胞介素(interleukin 10,IL10)表达增加。 Garcia 等[25]发现类似现象,BM-MSCs 治疗组小鼠海马区的老年斑显著减少,并伴随着星型胶质细胞和小胶质细胞数量显著减少。BM-MSCs 还可通过分泌因子调控神经元活性,据报道发现BM-MSCs 通过下调核因子E2 相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2, Nrf2)表达,降低氧化应激水平,减少神经元凋亡;也可通过上调营养因子,例如:脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF),神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达,增加神经元标志物NeuN 的阳性细胞数量,促进神经元修复。 此外,还可通过减少乙酰胆碱和多巴胺的表达,促进谷氨酸神经递质的表达。 在分子通路水平上,BM-MSCs 移植治疗组可上调糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3 beta, GSK-3β)表达量,激活Wnt 信号通路,促进海马区神经发生,增进神经元内源性修复[26]。 基于临床前动物模型的良好疗效,国际上开展了多项AD 治疗的临床实验,其中美国开展了两项同种异体BM-MSCs 治疗AD 的临床研究,目前两者分别处于在1 期和2 期阶段(NCT02600130 和 NCT02833792)[27]。

随着细胞传代培养,BM-MSCs 逐渐出现衰老表型,传代次数对BM-MSCs 的干性特征和分泌因子有显著影响,衰老死亡的BM-MSCs 将丧失治疗能力。全骨髓贴壁法分离的小鼠BM-MSCs 在第4 代可保持较好形态和多向分化能力。 然而,随着传代次数进一步增加,BM-MSCs 会出现细胞生长速度缓慢、核固缩、脱离等衰老特征。 大鼠BM-MSCs 的表面抗原CD29、 CD44 和CD90 表达随传代次数逐渐增加,经过5~6 代后达到顶峰,之后开始逐渐下降。 人源BM-MSCs 随着传代次数增加,其增殖能力和分化能力也均降低[28]。 梁维等发现第6 代的BM-MSCs 向神经干方向分化能力最强[29],一般认为7 代之前的BM-MSCs 有较强干细胞活性,适用于移植治疗研究。

2.2 基因修饰的 BM-MSCs 移植治疗 AD 小鼠模型

随着对AD 发病机理研究和认识的不断深入,众多参与AD 发生发展过程的重要调控蛋白、RNA分子被相继发现。 BM-MSCs 可作为一种新型基因治疗的载体细胞,通过基因修饰方法对其进行改造,将基因治疗与细胞治疗相结合,使BM-MSCs 和调控分子的效应叠加,更能有效缓解/阻止甚至逆转AD 的发展进程。 目前研究比较多的调控分子主要包括具有调控神经元生长和胶质细胞活性的分泌因子和非编码RNA。 BM-MSCs 的基因修饰方法包括电转导入、病毒导入以及转基因动物直接分离。 其中,尽管病毒载体介导的基因修饰方法具有较高的潜在成瘤风险,但因其操作简便,在临床前实验中可进行相关探索性研究。 据报道,基因修饰后的BM-MSCs 治疗AD 的副反应和成瘤能力可能高于单纯的BM-MSCs 细胞;因此,对其安全性进行充分验证将是后续研究工作的重点之一。 另外,导入目标基因的BM-MSCs 所处的代数会相应增加,干细胞的干性特征、生长特征以及分泌特征等会受到影响,在实践中应予以充分验证和考量。

Garcia 等[25]在过表达 VEGF 的 BM-MSCs 治疗APP/PS1 小鼠的实验中发现,治疗6 月龄AD 小鼠模型,潜伏期 WT ≈ AD (VEGF-BM-MSCs) < AD(BM-MSCs)

2.3 BM-MSCs 源外泌体治疗AD 动物模型

近年来,作为脱细胞治疗手段,源于干细胞的囊泡外泌体引起学者的广泛关注。 外泌体由磷脂双分子层包绕可溶性物质组成的复杂混合内容物构成,直径为30~150 nm[32]。 由于其可携带多种生物活性物质(蛋白质、DNA 和RNA 等),通过膜融合或内吞作用被受体细胞摄取,穿过血脑屏障,作用于神经元及其微环境中的多种细胞[33]。 外泌体携带的多种生物活性物质,可参与机体正常的生理功能及多种疾病的病理进程[29]。 因此,外泌体可规避传统BM-MSCs 应用中的局限性,外源性分离或者修饰外泌体内容物有望成为理想的“脱细胞”治疗手段。

Perets 等[34]在AD 小鼠注射了分离自 MSCs 的外泌体,24 h 后,实验人员观察发现外泌体具有向神经损伤区域迁移和归巢的能力,该功能与神经免疫反应的趋化能力密切关联。 Reza-Zaldivar 等[35]发现来源于MSCs 的外泌体可增强神经的可塑性,减缓Aβ 诱导的AD 小鼠认知障碍,进一步实验发现外泌体激活了SVZ 区的神经元生成,减少Aβ 淀粉样蛋白的沉积。 Xin 等[36]将从BM-MSCs 中超速离心分离的外泌体移植入中风的大鼠模型中,发现BM-MSCs 神经损伤得到缓解,这些外泌体中包含可以促进Aβ 蛋白降解的血清胱抑素C(Cystatin C)。外泌体还可通过将Aβ 转运至小胶质细胞的溶酶体中促进Aβ 清除;此外,外泌体能够通过释放脑啡肽酶/miRNA/鞘磷脂激活蛋白等多种方式营养神经元[37-40],从而改善认知功能。 Nakano 等[41]发现BM-MSCs 来源的外泌体可转移入损伤的神经元和星型胶质细胞。 多项研究发现外泌体携带的多种活性物质,尤其是小RNA(MicroRNA, miRNA),在调控靶基因表达,增进治疗效果方面有重要作用[42]。

BM-MSCs 在移植治疗中可能出现细胞排斥和血栓形成等风险,但其衍生的外泌体有如下优势:(1)体积较小,可通过血脑屏障,生物利用率高;(2)便于改造,使其大量携带目标的治疗效应因子;(3)可通过改造膜表面的受体-配体,定向某类细胞,靶向给药;(4)可通过静脉常规性给药,为药物研发提供了便利;(5)其纳米级尺寸,在给药中降低了微血管血栓形成的可能性[43]。

尽管外泌体在AD 的诊断和治疗中优势显著,但将其应用于临床仍有诸多问题需要解决,包括:(1)精确诱导细胞分泌含特定物质的外泌体的机制和方法尚未明确;(2)如何最大效率地将生物活性物质加载到外泌体中;(3)如何使外泌体选择性地靶向细胞并精确释放其内容物;(4)应用外泌体治疗的生物安全性也需要进一步的明确;(5)如何简便的获得大量外泌体。 综上,外泌体在AD 治疗中的作用及其机制的研究将为阿尔兹海默病的诊断和治疗提供新的方向。

3 BM-MSCs 治疗阿尔兹海默病模型小鼠的展望

BM-MSCs 用于AD 的模型小鼠治疗已经有数十年的历史,积累了大量的经验。 数据显示BM-MSCs可缓解多种 AD 模型小鼠认知功能障碍,但 BMMSCs 应用于临床还需要克服诸多问题,主要包括以下几个方面:(1)规范移植细胞/外泌体使用方案:目前大量的临床前期研究中,细胞/外泌体的质量要求和数量使用比较混乱,缺乏统一标准。 随着大量BM-MSCs 研究的开展,应制定统一的指导方案,既有助于多项研究的横向比较,为临床试验开展提供可靠的数据支撑,也会避免不必要的重复和浪费。 (2)确定干细胞输送到目标脑区的给药方式:目前治疗AD 动物模型的给药方式包括脑立体定位注射和尾静脉注射两种,其中动物实验中以脑立体定位注射海马区居多,在功能区达到较高的细胞浓度,用于探索BM-MSCs 的治疗效果。 该种方法为损伤性操作,一般单次治疗,在临床应用中有一定的局限性。 此外,研究者通过尾静脉多次注射BM-MSCs 治疗AD 小鼠模型,也可在一定程度缓解AD 小鼠症状,但该方法的优化和疗效收益需要进一步实验验证和评估。 近期,Santamaria 等[44]发现鼻腔内移植的MSCs 分泌物也可以缓解AD 小鼠的认知障碍,该方法是一种非侵入性方法,且可多次吸入给药,损伤较小,但文献报道较少,可作为新的备选方法在科学实践中确定其有效性和稳定性;(3)进一步评价BM-MSCs 使用安全性:干细胞治疗的安全性是和有效性同等重要的问题,有研究发现胚胎干细胞治疗帕金森病时,多只大鼠死于干细胞形成的肿瘤,因此,包括BM-MSCs 在内的干细胞治疗应该对于潜在的危险性充分论证,才能应用于临床实践[45-46]。 尽管BM-MSCs 走向临床还有一段距离,随着其治疗AD 的机制进一步被披露,安全性得到进一步验证,以及实验条件的日益成熟,BM-MSCs定将为MSCs 治疗AD 和其他神经系统疾病的治疗做出巨大的贡献。