外周血间充质干细胞在膝关节难治性运动创伤治疗中的应用研究进展

范宝石 张雪琳 叶景 孙泽文 韩超 宋士堂 许冰冰 余家阔

1 潍坊医学院（山东潍坊261053）2 北京大学第三医院运动医学科，北京大学运动医学研究所，运动医学关节伤病北京市重点实验室（北京100191）

在膝关节多种运动创伤中，膝关节关节软骨损伤、半月板损伤和交叉韧带断裂基本不能自愈，且这些损伤发生后，解决膝关节关节软骨、半月板和交叉韧带的结构和功能重建的手术难度也都较大，因此这几种损伤属于膝关节难治性运动创伤。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层、具有多向分化潜能的干细胞，在一定条件下可以诱导分化为骨、软骨、韧带、肌腱、肌肉、脂肪等组织细胞[1]。它具有良好的免疫调节活性和旁分泌能力[2]，能够释放合成细胞因子并直接分化成特异性结缔组织细胞，迁移到损伤部位，刺激祖细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进组织修复，且不会影响周围未受损组织细胞的正常生理活动，是再生医学领域最有临床应用前景的种子细胞，对于难治性运动创伤的治疗具有重要意义[3，4]。

外周血间充质干细胞(peripheral blood-derived mesenchymal stem cells，PBMSCs)的分化潜能与骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSCs)相似，但具有采集方便安全的独特优势，是一种容易获取并应用于基础和临床研究的成体干细胞种子来源[5]。我们对PubMed、Embase 和Web of Science数据库进行了系统文献检索，检索方式为：(peripheral OR blood OR circulating)AND(mesenchymal stem cell OR mononuclear cell)AND(cartilage OR chondrogenesis OR chondral OR ligament)AND(human OR patient OR animal OR mouse OR rat OR rabbit OR dog OR sheep OR pig OR horse OR ovine)，对使用PBMSCs再生修复膝关节软骨、交叉韧带和半月板的研究文献进行总结分析。

1 PBMSCs的分离培养、表征和优势

PBMSCs 的分离方法包括密度梯度离心法[6，7]、蛋白微珠分选法[8]、血细胞分离机分离法[9]等。其中，蛋白微珠分选法和血细胞分离机分离法获得的细胞纯度较高，但因费用高、操作复杂且影响细胞活性等原因较少采用；密度梯度离心法是利用PBMSCs和血细胞之间密度上的差异，在分离液的不同层次进行分离，同时因其符合正常生理性渗透压、不易破坏生物膜、对细胞无毒害、分离效果好且简便易行等优点而成为常用的分选方案。目前研究者采用不同的分离和培养方式从人[10]、马[2]、羊[11]、兔[12]、大鼠[13]和小鼠[14]的外周血中成功分离得到了MSCs，大多数的PBMSCs 获取需要提前用人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colonystimulating factor，HG-CSF)进行动员[15]。

现有的研究表明，PBMSCs 能够表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的标志物(CD29、CD105、CD166)和多能干细胞的标志物(Oct4)，但不表达造血细胞的表面标志物(CD14、CD34、CD45、HLA-DR)，这些表型特征与BMMSCs 相似[16]。同时，PBMSCs 具有良好的三系分化潜能，在不同的诱导条件下可以分化为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞等不同的谱系[17]。

除了具有与BMMSCs相似的表型特征和分化潜能外，PBMSCs 还有其他优势。比如PBMSCs 的获取过程不会给患者带来痛苦，避免了因抽取骨髓而产生一系列的并发症，如出血和慢性疼痛[15]。PBMSCs的优势还体现在患者年龄方面。外周血是从患者体内获取间充质干细胞的最方便来源，无论患者年龄多大都可以获取，而且获取后可以冷冻并储存起来供以后使用[18]。同时，由于PBMSCs可以通过微创的方式从自体动员和采集，无需手术获取，可真正实现自体移植，避免伦理上的限制[19，20]。

就取材途径以及对供体的影响而言，PBMSCs有望成为BMMSCs新的替代资源之一，从临床角度上，大部分医院具有成熟的血液采集流程以及外周血干细胞动员和采集操作步骤。血细胞分离机分离的每4ml 细胞悬液中的成软骨干细胞的数量即可满足临床使用。相比于BMMSCs，PBMSCs更容易在临床上进行推广。

体外实验也验证了PBMSCs 诱导分化成的软骨细胞的蛋白多糖染色、Ⅱ型胶原(collagen-Ⅱ，Col-Ⅱ)免疫组化染色比BMMSCs 分化来的软骨细胞阳性更强[21，22]。

膝关节内环境相对缺氧。研究发现，PBMSCs 比BMMSCs更耐受缺氧环境[22，23]。PBMSCs还具有高度的端粒酶活性，这使得细胞可以持续分裂，高达40 个群体倍增[24]。PBMSCs 具有成软骨能力强、耐缺氧、不良环境增殖能力强和干性维持好等特点，显示了其治疗难治性运动创伤的潜力[25]。

2 PBMSCs 在膝关节软骨、交叉韧带和半月板损伤治疗中的应用

2.1 PBMSCs 在膝关节软骨损伤修复中的基础研究和临床应用

PBMSCs具有软骨前体细胞的潜能，可启动透明软骨的重建[26-28]。PBMSCs的软骨分化是通过各种方法在体外实现的。在转化生长因子-β3(TGF-β3)诱导的成软骨细胞系中，二维培养的PBMSCs表达Ⅱ型胶原前体[29]。Tondreau 等利用TGF-β诱导PBMSCs 成软骨实验，培养2～3周后，蛋白多糖出现，表明软骨分化成功[30]。Saw等进行了一项体内实验研究，对软骨缺损患者进行软骨下钻孔，术后1周收集PBMSCs，每周1次关节腔内注射PBMSCs和透明质酸，共5周。术后二次关节镜评估结果显示治疗部位透明软骨再生[31]。另外一项体内实验结果显示，HG-CSF动员后的PBMSCs在自体松质骨支架上启动软骨细胞分化，富血小板血浆的加入进一步刺激细胞向Sox9(sry related hmg box 9)转录增强的软骨细胞表型增殖，引起Col-Ⅱ和葡糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAG)mRNA的顺序增加，组织学结果显示新形成的透明软骨中蛋白多糖和氨基葡萄糖多糖含量增加[32]。此外，PBMSCs还可以促进膝关节髌骨下脂肪垫来源的间充质干细胞向软骨破损处迁移和分化[33]。

在绵羊[18]和兔[34]软骨缺损治疗模型中，PBMSCs 治疗与BMMSCs 治疗同样有效，两种干细胞具有相似的体内软骨形成能力。Zhao 构建的PBMSCs 复合改良脱钙骨基质新型组织工程软骨对猪软骨缺损具有良好的修复作用[35]。有研究结果表明，相比于单独使用透明质酸，联合PBMSCs的关节内注射可以在体内明显抑制大鼠骨关节炎(osteoarthritis，OA)的进展[36]，关节内注射PBMSCs是治疗OA的一种方便有效的方案[37]。

临床研究利用PBMSCs 进行膝关节软骨损伤患者体内修复和再生的成果从主客观功能评分、放射学检查、关节镜二次检查和组织病理学等方面证实了PBMSCs 的安全性和有效性。应用PBMSCs 治疗国际软骨修复协会(international cartilage repair society，ICRS)Ⅲ/Ⅳ级软骨病变、不同病因的骨软骨病变、早期骨关节炎软骨病变和大面积全层软骨缺损的4项临床试验评价结果显示：治疗后患者KOOS 评分[38-40]、Lysholm 评分[38，39]、WOMAC 评分[40]、IKDC 2000主观评分[41]和Tegner 评分[41]均较治疗前有所改善，VAS 评分[38，39]较治疗前减轻，差异有统计学有意义。放射学检查作为一种非侵入性检查方法，被广泛用于评价软骨修复和再生的效果。应用PBMSCs治疗ICRS Ⅲ/Ⅳ级软骨病变、不同病因的骨软骨病变、早期骨关节炎软骨病变和大面积全层软骨缺损的6 项临床研究使用MRI[38，39，41，42]、X射线[20，31]或CT[41]来评估修复效果，并报告治疗后形态学评分较治疗前改善，差异有统计学意义，再生组织与正常软骨、软骨下骨信号相同。其中有4 项人体研究通过关节镜二次检查的方法评估软骨修复效果，认为PBMSCs产生的软骨再生效果与BMMSCs相当，再生的软骨与正常软骨组织相似[20，31，41，42]。其中有4 项人体研究报告了经PBMSCs 治疗后ICRS 评分改善，组织学观察到软骨再生明显[20，31，40，42]。

2.2 PBMSCs 在膝关节交叉韧带损伤修复中的作用已在大动物模型和细胞模型中有了初步研究结果

有学者研究了PBMSCs 在膝关节交叉韧带损伤治疗中的安全性和有效性。一项马同种异体PBMSCs 静脉注射研究证实了PBMSCs 注射对大动物的安全性。291 匹正常马接受了多次静脉注射同种异体来源的PBMSCs，均未表现出不良反应，表明同种异体PBMSCs的静脉注射是安全的[43]。Proffen 等分别将髌后脂肪垫来源的间充质干细胞、PBMSCs与猪前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)成纤维细胞进行共培养，结果表明PBMSCs 对交叉韧带成纤维细胞迁移的刺激作用比髌后脂肪垫来源的间充质干细胞更强[44]。一项研究在猪ACL 横断的膝关节模型中注射PBMSCs 进行修复，结果发现注射前后的交叉韧带成熟度指数、生物力学和组织学方面并没有显著的差异[45]，PBMSCs用于交叉韧带再生的临床应用还需要进一步研究。

2.3 PBMSCs 在膝关节半月板结构和功能重建领域的应用值得重视

虽然尚未见PBMSCs 在治疗半月板损伤方面的应用研究文献，但是其他种类的MSCs治疗膝关节半月板损伤的研究有很多，其中大部分都是骨髓来源的间充质干细胞[46，47]。本项目组以动态拉伸-压缩加载系统结合两种生长因子的方式构建负载BMMSCs的组织工程半月板，将其植入兔内侧半月板全切模型中进行半月板修复，重建了半月板的正常结构和功能，证实了异质性组织工程半月板在体内长期保护膝关节软骨的效用[48]。

本项目组的研究已经表明，PBMSCs与BMMSCs相比具有耐缺氧特点[49]且有更好的成软骨能力[21]，因此，PBMSCs 对半月板白区的修复是否比其他干细胞更有优势值得探讨，PBMSCs更好的成软骨能力是否更有利于半月板这种纤维软骨组织的修复再生也值得关注。

3 小结与展望

干细胞药、干细胞植入材料和干细胞组织工程将推动运动医学领域伤病治疗的革命性变革[17，35，50]。PBMSCs作为一种有前途的干细胞来源，目前研究结果已经显示其在关节软骨损伤修复和交叉韧带损伤治疗方面的潜在价值，尤其在关节软骨损伤修复方面，PBMSCs 移植修复大面积软骨损伤已经在临床上得到应用。相比于PBMSCs在关节软骨损伤修复中的应用，PBMSCs在交叉韧带损伤修复中的研究才刚刚起步，其在交叉韧带损伤修复中的潜力值得重视。对于股骨和胫骨之间、受力环境特殊的半月板组织损伤后的结构和功能重建来说，具有耐缺氧和软骨分化优势的PBMSCs的应用研究值得探讨。