2-羟基戊二酸在异柠檬酸脱氢酶突变型胶质瘤发生、发展中的作用及磁共振波谱检测方法

葛 颖，俞梅美，沈慧聪*

(1.首都医科大学附属北京天坛医院放射科，北京 100070；2.北京市回民医院放射科，北京 100054)

经年龄校正后，2012—2016年美国中枢神经系统肿瘤平均年发病率为23.41/100 000，其中恶性者约占30.2%，以胶质瘤最多见[1]。WHO依据组织病理学及临床诊断标准将中枢神经系统肿瘤分为Ⅰ～Ⅳ级。随着基因组测序技术的发展，2016年WHO将分子表型引入中枢神经系统肿瘤分类，基于异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)将弥漫性胶质瘤分为IDH突变型、IDH野生型及非特异型[2]，约80%～90%的Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤及多数继发性胶质母细胞瘤肿瘤组织中存在IDH突变[3]。2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutarate，2-HG)为IDH突变型胶质瘤的特征性代谢产物，通过竞争性抑制α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)依赖的双加氧酶，多方面影响肿瘤发生、发展及侵袭过程。磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy，MRS)为无创性检测2-HG的影像学方法。本文对2-HG在IDH突变型胶质瘤发生、发展中的作用及MRS检测2-HG方法进展进行综述。

1 IDH突变与2-HG

IDH(包括IDH1、IDH2及IDH3)为小分子蛋白，是体内具有脱羧作用的氧化还原酶，催化三羧酸循环中异柠檬酸氧化脱羧生成α-KG，并在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)还原为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的过程中起重要作用。生物体内的IDH包括NADP依赖型(IDH1、IDH2)及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型(IDH3)2种存在形式。IDH1存在于胞质及过氧化物酶体中，除维持生物体抗氧化系统外，还可促进脂质合成；IDH2存在于线粒体中，主要参与细胞能量代谢；脑胶质瘤尚未发现存在IDH3。IDH突变发生于神经胶质细胞自干细胞分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞的早期。IDH1/2突变时，其功能及代谢产物将会发生改变；突变的IDH催化异柠檬酸代谢生成2-HG[4]。

2 2-HG与IDH突变型胶质瘤

2-HG包括D-2-HG及L-2-HG，前者仅由突变的IDH催化生成。2-HG与α-KG为对映体，是α-KG依赖的双加氧酶的竞争性抑制剂。人体中存在60余种依赖α-KG的双加氧酶，且与多种途径有关，涉及胶原、组蛋白、转录因子、烷基化脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)、脂质、抗生素、基因组中DNA的5-甲基胞嘧啶及RNA的6-甲基腺嘌呤。2-HG对α-KG依赖的双加氧酶的竞争性抑制影响多条细胞通路[5]。2-HG水平对于诊断IDH突变及预测患者预后、评估复发具有重要意义[4,6]。

2.1 胶质瘤发生 2-HG通过阻止干细胞分化、抑制抑癌基因活性、降低DNA修复速率及逃避宿主免疫系统对肿瘤攻击的方式而影响IDH突变型脑胶质瘤的发生。2-HG竞争性抑制Jmj-C结构域组蛋白去甲基化酶，使组蛋白3赖氨酸甲基化水平明显升高，可阻止干细胞正常分化[4]；同时，2-HG可竞争性抑制α-KG依赖的DNA甲基转移酶催化活性，阻止DNA去甲基化，致DNA高甲基化广泛存在；2-HG还竞争性抑制10-11位转位蛋白双加氧酶活性，致DNA去甲基反应中介体——5-羟甲基胞嘧啶减少。以上3条通路使CpG岛高甲基化表型广泛存在于分化受阻的干细胞中，可致抑癌基因失活[7]。另一方面，2-HG竞争性抑制烷烃羟化酶家族蛋白氧化去甲基酶活性，使细胞中DNA的修复速率下降而加重DNA损伤[8]，诱导肿瘤发生。最近研究[9]表明，2-HG可抑制补体激活途径，抑制脑胶质瘤组织标本中肿瘤性T细胞的增殖、吞噬和细胞因子的分泌，有助于肿瘤逃避宿主免疫系统的攻击。

2.2 胶质瘤发展 机体中还存在其他依赖α-KG的双加氧酶，如含脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase，PHD)的结构域蛋白及胶原蛋白脯氨酰4-羟化酶(collagen prolyl 4-hydroxylase，C-P4H)。正常氧含量环境下，缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)亚基被PHD(PHD1、PHD2、PHD3)羟基化，进而被希佩尔-林道(von Hippel-Lindau)蛋白识别、泛素化，最后被蛋白酶降解。2-HG竞争性抑制PHD，尤其是PHD2时，HIF-1α上调，促进正常星形胶质细胞增殖，诱导血管内皮生长因子及促红细胞生成物表达，促进肿瘤血管形成及葡萄糖代谢，进而影响对肿瘤生长至关重要的其他信号通路[6]。SEMUKUNZI等[10]认为D-2-HG的产生可刺激PHD2介导的HIF-1α降解，而在某些IDH突变细胞类型中出现的PHD抑制可能是某种间接影响的结果。L-2-HG在缺氧条件下积聚亦非IDH介导，故2-HG对HIF-1α的影响尚有争议[11]。

2-HG竞争性抑制胶原蛋白-脯氨酰羟化酶，使Ⅳ型胶原螺旋结构形成障碍，羟脯氨酸、羟赖氨酸介导的胶原蛋白修饰被破坏，致Ⅳ型胶原成熟障碍，破坏基底膜，触发内质网应激反应[4,12]；而基底膜异常在脑胶质瘤的发展中起着重要作用[13]。

3 MRS检测2-HG

免疫组织化学及基因组序列分析是检测IDH突变的金标准。检测2-HG的传统方法包括液相色谱-质谱法和利用同位素标记戊二酸作为内参、气相色谱-质谱联用法，仅能测定甲醛溶液固定后石蜡包埋样本中的2-HG水平[6,14]。无创获取肿瘤性质信息具有重要临床意义[15]。诸多影像学方法中，MRS被认为是非侵入性检测2-HG水平的理想方法[16]。临床应用中，2-HG谱峰与具有类似结构的谷氨酸(glutamic acid，Glu)及谷氨酰胺(glutamine，Gln)谱峰存在大量重叠，使得如何分离2-HG特征性谱峰成为MRS检测2-HG的最大挑战。

3.11H-MRS检测2-HG

3.1.1 扫描场强 MRS扫描常用场强为3.0T。MEKLE等[17]发现7.0T较3.0T具有更高的光谱分辨率及更好的信噪比(signal noise ratio，SNR)。9.4T场强下，光谱分辨率进一步提高，可观察到肿瘤代谢产物2-HG以及α-KG减少导致的代偿性Glu及Gln峰值减低和NADPH消耗所致谷胱甘肽峰减低。但高场强也存在局限性，如化学位移偏差、场强不均匀及短重复时间(repetition time，TR)引起的T1污染对代谢物质定量测量的影响等[18]。

3.1.2 扫描序列 点解析波谱(point-resolved spectroscopy，PRESS)是MRS最常用序列，该序列显示位于2.25 ppm的谱峰具有良好的准确率及SNR[12]。但BRANZOLI等[19]认为 PRESS序列生成的波谱图像中位于2.25 ppm的2-HG峰仍部分与其他代谢产物谱峰重叠，而Meshcher-Garwood点分辨光谱法(Meshcher-Garwood point resolved spectroscopy，MEGA-PRESS)序列波谱图像中位于4.02 ppm的2-HG谱峰去除了其他代谢产物的影响，可更准确地定量2-HG水平，且更适用于检测靶向治疗过程中2-HG水平变化；虽然MEGA-PRESS序列的SNR低于PRESS，以MEGA-绝热式选择性重聚波谱替代MEGA-PRESS可有效加以弥补。对于单体素波谱(single-voxel spectroscopy，SVS)或多体素化学位移成像(chemical shift imaging，CSI)采样体素定位，ZHOU等[20]认为SVS对术前诊断IDH突变型胶质瘤价值更高，而CSI在鉴别IDH突变型胶质瘤复发中表现更好。

3.1.3 扫描参数 SASAKI等[12]发现回波时间(echo time，TE)影响检测2-HG的敏感度及特异度。俞梅美等[21]在3.0T场强下应用PRESS序列对比TE=35 ms(TE1=21 ms，TE2=14 ms)及TE=97 ms(TE1=32 ms，TE2=65 ms)的检测效率，结果显示TE=97 ms更有利于定位体素，且在2.25 ppm处可更清晰地显示窄2-HG峰，以与邻近的Glu、Gln及γ-氨基丁酸峰区别。CHOI等[22]认为以较短TE、较长TR可获得完整的代谢物信号，更适用于精确地定量测量2-HG水平。

3.1.4 体素范围 检测2-HG的敏感度在很大程度上依赖于体素范围，体素为8 ml是MRS分辨率的下限[23]。既往研究[14]发现测量肿瘤内小范围体素的敏感度较全体素均值更高，但这也是术后复查MRS时选择体素的主要难点。选择体素时原则上应包括肿瘤范围，并使部分容积效应最小化，2 cm×2 cm×2 cm为最常用体素范围。

3.1.5 图像处理 常用于定量分析2-HG的谱峰编辑软件包均基于基谱拟合法，包括LCModel、QUEST及AQSES，区别在于对背景，即未知代谢物及大分子参数的估计方法不同。LCModel基于预先定义大分子及脂质的基组，临床最为常用[12]；QUEST假设背景包含快速衰减成分，并允许极端点；AQSES则利用反傅里叶转换样条基组，通过扩展代谢物基谱，即将大分子纳入基组而建模[24]。此外，LCModel于频域上执行拟合，而QUEST及AQSES则在时域上执行拟合。WENGER等[24]认为确定拟合域(时域或频域)和基线矫正是影响2-HG谱峰编辑的重要因素。

3.1.6 判读结果 多以2.25 ppm处的2-HG绝对浓度作为诊断IDH突变参考值，范围0.897～2.000 mmol/L，也有学者[12]推荐以1.76 mmol/L作为最佳参考值。SUH等[14]推荐，TE=97 ms单体素PRESS序列下，2-HG阈值为1 mmol/L。另有研究[14,25]认为，基于水浓度在正常脑组织、肿瘤组织及不同类型肿瘤组织中恒定的假设测量2-HG绝对浓度因无法去除水肿严重程度、肿瘤细胞及组织学类型、肿瘤组织正确分割等混杂因素而与真实值有所差异，引入内源性肌酸(creatine，Cr)很好地解决了上述问题，并推荐SVS序列中2-HG/Cr阈值为0.11，CSI序列中2-HG/Cr阈值为0.23。鉴于IDH突变除2-HG外还带来其他代谢产物变化，以2-HG结合其他代谢产物作为诊断IDH突变的生物学指标具有一定临床意义。俞梅美等[21,26]认为TE=97/93 ms单体素PRESS序列总2-HG水平升高，结合Glu水平下降作为诊断标准较仅以2-HG水平作为诊断标准的敏感度更高，并推荐以2-HG>1.8 mmol/L或Glu<3.9 mmol/L作为诊断IDH突变的标准。

除技术因素影响2-HG检出率外，SUH等[27]发现瘤体本身因素亦可影响2-HG检出，如坏死超过20%及表观弥散系数(apparent diffusion coefficient，ADC)较低与2-HG假阳性有关，原因在于坏死区内含脂质，部分于2.0～2.9 ppm产生共振，可能增加2-HG测量点的信号；而ADC较低与2-HG假阳性相关的原因有待进一步探讨。

3.213C-MRS检测2-HG 除1H-MRS外，PICHUMANI等[28]认为在组织活检和肿瘤提取物13C-MRS的基础上输注富含13C标记的底物分析肿瘤代谢可能是具有潜力的方法。采用低温冷却后的13C探针可显著提高检出2-HG谱峰的敏感度。另有研究[28]发现利用三维功能光谱图动态定量测量2-HG可监测IDH突变型胶质瘤患者对于治疗的反应。

总之，2-HG富集是IDH突变型胶质瘤最有特征性的代谢改变，且在肿瘤发生、发展及侵袭过程中具有重要作用。作为无创性检测2-HG的影像学方法，MRS在IDH突变型胶质瘤的诊断、判断预后及评估复发等方面具有一定临床价值。但目前MRS尚缺乏规范的扫描方案，通过改进场强、扫描序列、TE及选择频谱编辑方法等和优化判读指标，可改善MRS对2-HG谱峰的显示能力，拓展其临床应用范围。