原发性卵巢功能不全患者原始卵泡体外激活技术

宋文广，付浩，郭敏，胡春秀

原发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）是女性不孕的重要原因之一，其总患病率约为1%。欧洲人类生殖与胚胎学会2020年制定的POI诊断标准为：40岁以下女性少经或闭经4个月以上，且间隔4周以上连续2次检查均卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）＞25 U/L[1]。目前POI患者的治疗主要是通过供卵途径实现生育，但是由于我国卵子来源有限，供需严重失衡，等待合适的卵源往往需要数年时间，导致患者的生育目的很难实现。同时供卵来源胚胎没有其生母的基因遗传特性，也可能会导致一定社会及伦理问题[2]。2010年原始卵泡体外激活（in vitro activation，IVA）技术的提出，为POI患者的生育需求提供了新的解决办法。在POI患者体内，虽然检测不到发育的卵泡，但是有超过一半的患者的卵巢皮质中仍存在原始卵泡，这些原始卵泡可能由于数目过少或其他原因导致无法激活并发育。IVA技术可通过药物或非药物手段在体外处理卵巢组织，激活卵泡发育相关信号通路，将卵巢中残存的原始卵泡重新唤醒[3]。2013年首次报道应用IVA技术使得POI患者成功分娩1名活婴，这为IVA技术的临床应用奠定了基础[4]。现对IVA技术的研究进展进行综述，以期为POI患者制定治疗策略提供参考。

1 卵泡发育过程

卵巢实质部分可分为中央的髓质和外周的皮质，髓质主要由疏松结缔组织构成，血管与神经分布较多，皮质部分含有不同发育阶段的卵泡、闭锁卵泡、黄体和白体等[5]。卵泡具有明显的年龄性变化：5个月的胎儿时期，两侧卵巢内共有700万个原始卵泡，到新生儿时期有70万～200万个原始卵泡，青春期时仅剩约4万个原始卵泡，围绝经期时则仅存数百个。女性一生可排出400～500个成熟卵泡，其余的均在不同发育阶段退化成闭锁卵泡[6]。卵泡的发育分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡4个阶段。原始卵泡位于卵巢皮质的浅层，体积小，数量多，由1个初级卵母细胞和周围扁平的卵泡细胞构成。初级卵母细胞是在胚胎时期由卵原细胞分裂分化而来，出生前卵原细胞已发育形成初级卵母细胞，并长期停滞在第一次减数分裂的前期，停滞时间可达12～50年，直至排卵前才完成分裂。进入青春期后，卵泡在促性腺激素的作用下开始发育成熟。初级卵泡和次级卵泡合称为生长卵泡，由原始卵泡发育而来，最终发育为成熟卵泡。成熟卵泡体积增大，直径可达2 cm以上，并突向卵巢表面，卵泡中的初级卵母细胞于排卵前36～48 h完成第一次减数分裂，形成1个次级卵母细胞和1个第一极体。新形成的次级卵母细胞立即进行第二次减数分裂，停滞在第二次减数分裂的中期。排卵时，次级卵母细胞外裹放射冠和透明带，随卵泡液排出卵巢。

2 IVA相关信号通路

2.1 Hippo信号通路Hippo信号通路在哺乳动物体内较为保守，对于控制细胞凋亡与再生发挥重要作用。Hippo信号通路主要由几个负性调节因子组成，包括哺乳动物不育系20样激酶1/2（mammalian sterile 20-like kinases，MST1/2）、SAV1（Salvador homolog 1）和大肿瘤抑制因子1/2（large tumor suppressor，LATS1/2）等[7]。当外源信号刺激Hippo信号通路时，活化的MST1/2与SAV1结合形成复合物，使LATS1和LATS2激酶磷酸化，并通过级联作用，最终磷酸化关键的转录辅助激活因子，包括YES相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）、带有PDZ结合基序的转录共激活因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）等，导致它们在细胞质滞留，最后被相关蛋白水解酶降解[8]。当Hippo信号中断时，核内YAP与转录增强相关结构域（transcriptional enhanced associate domain，TEAD）的转录因子协同作用，增加下游半胱氨酸富集61因子、结缔组织生长因子、肾母细胞瘤过度表达生长因子和含有凋亡抑制剂的杆状病毒凋亡重复抑制因子等蛋白的表达，促进磷酸化的YAP和TAZ入核，并通过调节相关靶基因刺激细胞生长、存活和增殖。研究表明Hippo信号通路蛋白可调节肝脏生长，肝细胞中SAV1或MST1/2基因缺失可造成小鼠肝脏增大[9]。在卵巢相关疾病中，Hippo信号基因的缺陷与多囊卵巢综合征、卵泡储备降低和卵巢上皮细胞肿瘤的发生有关[10]。在卵巢衰老的过程中，Hippo信号通路相关分子可通过调控卵巢生殖干细胞的增殖参与卵巢功能的生理性衰老和病理性衰老过程[11]。

2.2 磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）信号通路PI3K/AKT信号通路是IVA研究中较为成熟的一个通路。当受到外源信号刺激时，PI3K可通过级联反应将磷脂酰肌醇4，5-双磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）转化为磷 脂 酰 肌 醇3，4，5-三 磷 酸（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3），当刺激信号源消失或减弱时，PIP3则会转化为PIP2，二者达成动态平衡[12]。在这个过程中，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10，PTEN）作为PIP3的拮抗剂，可促进PIP3转化为PIP2，从而降低细胞内PIP3含量[13]。PIP3既可以直接与AKT发生反应，也可与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（3-phosphoinositidedependent protein kinase 1，PDK1）结合间接激活AKT，促进叉头框蛋白O3a（forkhead box protein O3a，FOXO3a）磷酸化并使其从细胞核内向细胞核外转移[14]。FoxO3a在卵母细胞核中的持续存在或表达增加可阻断前颗粒细胞与卵母细胞之间的物质交换，从而抑制原始卵泡的激活和发育，这对维持原始卵泡库具有重要意义。当FOXO3a磷酸化并且从卵母细胞的核内转移到核外时，可解除对原始卵泡发育的抑制，进而激活原始卵泡[15]。2010年，Li等[3]首先提出IVA技术可能成为POI患者的潜在治疗策略。该团队用PTEN抑制剂和PI3K激活剂体外处理新生小鼠卵巢，激活休眠的原始卵泡，随后将其移植到卵巢切除的成年小鼠肾囊中，并给予FSH处理以促进卵泡生长。研究发现该方法可培育出成熟卵子，并且通过体外受精（in vitro fertilization，IVF）技术还能使卵子进一步发育成有生育能力的子代。进一步研究发现，用同样的方法将含有原始卵泡的人卵巢皮质碎片移植到免疫缺陷小鼠体内后，可见原始卵泡发育成为含有成熟卵母细胞的大的有腔卵泡，提示该方法可激活休眠的人类原始卵泡，但由于伦理问题未进行下一步的IVF。

2.3 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信号通路mTORC1是一种保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，受生长因子、能量、氧浓度、压力和营养等状态的影响，可调节细胞生长与代谢。其主要受上游负性调节因子结节性硬化症复合物1/2（tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2）的调控[16]。有学者通过高脂饮食诱导mTORC1信号通路表达增强，发现其可加速原始卵泡发育并向初级卵泡转变。mTORC1信号通路主要通过调节前颗粒细胞与卵母细胞的信号传导发挥原始卵泡激活作用。卵母细胞与前颗粒细胞之间的信号传导促进了两者的协同发育。敲除小鼠前颗粒细胞中mTORC1信号通路抑制因子TSC1基因后，可见颗粒细胞分泌的KITL（KIT ligand）因子表达增加，其与卵母细胞表面的酪氨酸激酶受体结合后可激活PI3K信号通路，促进卵母细胞发育[17]。当敲除mTORC1调控相关蛋白后，可见前颗粒细胞与原始卵泡同时保持休眠状态，提示mTORC1信号通路的激活可促进原始卵泡激活[14,18]。

3 IVA在临床实践中的应用

3.1 药物IVA2013年，Kawamura团队基于Hippo和AKT信号通路影响原始卵泡发育的理论进行了IVA人体试验[4]。研究共招募27例POI患者，其中13例患者卵巢内可见原始卵泡。首先在腹腔镜下将卵巢皮质分割成1 mm×1 mm小块，以破坏Hippo信号通路，继而经过AKT激活剂体外处理2 d后，在双侧输卵管浆膜下各移植40～80个卵巢小块。接下来每周或每两周监测一次卵泡生长情况以及血清激素变化，当卵泡直径＞5 mm后患者每天接受FSH治疗，然后在卵泡直径＞16 mm时注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG），36 h后经阴道超声下取卵。最终在8例患者中发现有卵泡生长，其中5例患者取出了成熟卵泡，经过卵细胞质内单精子注射（intra cytoplasmic sperm injection，ICSI）后最终有1例患者成功分娩1名健康婴儿。2016年，郑州大学第一附属医院报道了中国首例应用IVA技术成功分娩的POI患者[19]。该团队纳入了14例POI患者，平均年龄29岁，通过腹腔镜摘除患者一侧卵巢，卵巢取出后立即转移到实验室恒温37℃培养箱中，剥离卵巢皮质并切成条状，将一部分卵巢组织切成1 mm×1 mm的小块，然后将其放入含有PTEN抑制剂和PI3K激活剂的培养基中孵育，剩余的卵巢组织采用玻璃化冷冻法冷冻保存。用10%～20%的卵巢条索进行组织学分析，以确定残余卵泡的存在。经过2 d的IVA后，腹腔镜下将卵巢小块移植到两侧输卵管浆膜下，结果发现，7例患者切除的卵巢中仍有残存的原始卵泡，最终有1例患者成功分娩健康男婴，另有3例患者进行了胚胎冷冻保存。

3.2 非药物IVA既往研究表明，原始卵泡在富含胶原的卵巢皮质中的定位，赋予了卵泡支持结构和限制卵泡扩张的刚性物理环境，原始卵泡中的卵母细胞被周围分泌细胞外基质蛋白的颗粒细胞压缩，导致高机械压力状态从而保持休眠状态，当原始卵泡细胞外基质结构降解后可使原始卵泡激活。近年来随着对卵巢Hippo信号通路研究的不断深入，发现机械刺激卵巢可干扰并阻断Hippo信号通路，促进原始卵泡发育，IVA技术也有了新进展。研究发现，卵巢切除可诱导肌动蛋白聚合一过性增加，YAP磷酸化降低，导致细胞核YAP水平升高，随后下游生长因子（细胞周期蛋白）和凋亡抑制因子（含有凋亡抑制剂的杆状病毒凋亡重复抑制因子）表达增加[20]。基于此，有学者使用简化的非药物IVA程序，无需AKT刺激物（PTEN抑制剂和PI3K激活剂）孵育2 d，仅腹腔镜手术下进行卵巢取材、分割和原位移植，在14例POI患者中有5例取卵成功，每个取卵周期的累积妊娠率为57%，最终有2例活产，1例于26周早产后婴儿死亡，1例持续妊娠[21]。Kawamura等[22]研究纳入11例非药物IVA治疗的卵巢低反应合并卵巢储备降低的患者，经过腹腔镜下卵巢取材、分割后立即将卵巢小块移植回患者体内，有9例经FSH治疗后，在多个月经周期中可见有腔卵泡数增加，随后提取成熟卵母细胞进行IVF，5例患者进行了16次胚胎移植，最终1例活产，2例持续妊娠，1例流产。该IVA程序节省了2 d的药物孵育步骤，在将卵巢皮质分割后立即移植卵巢小块，避免了长时间培养过程中可能发生的卵泡丢失。此外，只需要1次腹腔镜手术，甚至手术也可以在门诊进行，将患者的不适和治疗成本降至最低。由于进行了原位移植，一些患者在没有取卵和IVF-胚胎移植的情况下可能会自发妊娠。

4 结语与展望

约50%的POI患者卵巢内仍含具有发育潜能的残留卵泡，IVA技术为POI患者提供了一种潜在的不孕症治疗方法。这些手术方式看似在“破坏”卵巢，与传统的减少器官损害思维背道而驰，但该过程类似于女性每月1次的卵巢重塑，与生理状态也有类似之处。然而目前的IVA仍有一些问题有待解决，一是妊娠率较低，活产率更低，如何有效提高IVA后的妊娠率值得探讨；二是无论药物IVA还是非药物IVA，卵巢移植本身会对卵巢储备造成严重损伤，如何降低这种损伤或是寻求一种新的原位IVA手段，对于提高IVA的成功率具有重要意义。