多相支架在牙周再生领域的研究进展

巩靖蕾 黄艳梅 王军

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院正畸科 成都 610041

牙周组织是由牙龈、牙周膜、牙骨质及牙槽骨共同组成的复杂牙齿支撑结构，在为牙齿提供营养的同时发挥固定、支持和传递咀嚼力的重要功能[1-2]。牙周炎与牙周致病菌大量入侵、牙周菌群失衡、自身免疫反应以及吸烟等危险因素相关[3]。该疾病一旦发生便难以逆转，最终导致牙齿松动、脱落[4]。流行病学调查显示，慢性牙周炎在我国成人中患病率高达80%以上[5]，是造成我国成年人失牙的主要原因[6]，给患者带来严重的健康与美观问题。同时有研究[7-11]表明：牙周炎也与心血管疾病、糖尿病、阿尔茨海默病、胃肠道疾病、呼吸道感染及不良妊娠结局等系统疾病的发生和发展密切相关。

组织工程技术和生物材料一直是牙周再生（periodontal regeneration）的研究热点，其中多相支架（multiphase scaffolds）是一种同时具备多种内部结构（例如不同孔隙度、孔隙尺寸、孔隙形状等）和/或多种生化成分的复杂支架材料[12]，可以通过区域特异性的各相优化不同组织的再生修复。近年来多相支架的迅猛发展增加了多组织同时再生的可行性，被广泛应用于骨-软骨、牙周复合体等复杂修复领域[13]。本综述从牙周复杂再生需求和多相支架优势入手，概述多相支架结合生长因子、干细胞技术、3D打印、微图案处理等新兴技术以及其对现有牙周治疗的补充与完善，探究多相支架在牙周组织结构和功能再生中的应用潜力。

1 多相支架材料与牙周复杂再生

生物支架材料能够支撑再生所需空间，引导细胞增殖迁移，已经成为组织工程中稳定成熟的一环。支架内部可以同时具备各异的物理、化学及生物学性能，根据其特异性区域数量及分布情况，可将其分为单相、双相和多相支架[13]。单相支架受到自身结构及成分的限制，无法满足多组织同步再生的需求[4,14]；而多相支架内部结构和（或）功能成分的多样则有益于重建各组织界面固有的关键结构与功能关系，最终实现功能性新附着的形成。另外，多相支架仍保留有支架材料的优良特性，例如宏观尺寸、力学性能与降解速率等都可精准控制，足以适应与支撑形态多变的缺损区域，为再生提供空间。因此，多相支架有望实现同时涉及软硬组织的多组织再生修复。

随着医疗卫生的进步，牙周组织再生的概念也在不断发展和完善。牙周再生不仅仅涉及牙骨质、牙周膜、牙槽骨3种组织的简单形成，更强调三者高度协调的时空关系以及牙周组织功能的重建[1-2,15]。这就要求牙周膜-牙骨质、牙周膜-牙槽骨及宿主环境之间实现良好整合，再生牙周膜纤维的两端应分别插入新生牙骨质与牙槽骨之中，同时恢复其定向排列与一定的生理斜度，以重建其生理负荷和牙周稳态[16-17]。目前越来越多的研究将多相支架的结构、成分和功能进行不断改进，以实现牙周复合体再生的靶向优化。应用于牙周组织再生的多相支架的各相通常根据目标再生的组织名称分别命名为牙周膜相、牙槽骨相、牙骨质相，具有良好特异性的同时又高度协调一致，共同满足牙周复杂再生的需求。

2 多相支架作为生长因子传递系统用于牙周组织再生

多相支架的各相可以分别负载多种生物活性分子，将其传递给对应组织，对牙本质/牙骨质、牙周膜和牙槽骨的再生分别进行优化，表现出强大的空间特异性。Sowmya等[18]设计合成多相纳米复合水凝胶支架，其牙骨质相、牙周膜相和牙槽骨相分别负载牙骨质蛋白1（cementum protein 1，CEMP1）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）和富血小板血浆生长因子（platelet-rich plasma，PRP）。该牙周修复材料表现出对人牙囊干细胞成牙骨质、成纤维及成骨向分化的调控作用，实现了新生牙骨质、高密度的牙槽骨及两者之间斜行牙周膜纤维的共同复杂再生。Huang等[19]设计的双相冷冻凝胶支架，包括含有明胶的软组织相和进一步结合β-磷酸钙/羟磷灰石颗粒的硬组织相，分别缓释牙釉质基质衍生物（enamel matrix derivatives，EMD）和骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2），同样表现出强大的牙周复合体再生能力。

更重要的是，多相支架还表现出负载分子传递的时序特异性。首先多相支架中各相孔径的差异可以影响递送速率。有研究[20]表明：多相支架的各相分别携带重组人釉原蛋白（recombinant human amelogenin，rHAM）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor）及BMP-2，利用各异的微通道直径来调控其释放速度，促进成牙骨质、成骨、成胶原相关基因的区域特异性表达，实现了牙周复合体的再生。其次，多相支架多样的内部结构和组成成分也导致了活性分子扩散途径的差异。Ding等[21]利用同轴静电纺丝技术制备核-壳结构纤维，将降解速度快的聚乳酸-羟基乙酸共聚物 ［poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA］ 作为外壳而降解时间较长的聚乳酸［poly(L-lactic acid)，PLLA］作为内核，实现了外壳中FGF的初期突释和内核中BMP-2长达4周的缓慢稳定释放，分别促进早期间充质干细胞向缺损部位的大量募集与增殖和后期其成骨成纤维的多向分化，显著提升了修复进程。

生长因子相关的基因治疗因其良好的传递效率和稳定性，有望成为生长因子的有效替代方法。已有研究[22]将介孔生物玻璃材料与多孔纺丝纤维有序组合构成多相支架。Zhang等[23]将血小板衍生生长因子 （platelet derived growth factor，PDGF）及BMP-2的腺病毒与该复合多相支架结合，体外实验证实前者能够更多地募集牙周膜干细胞而后者可诱导其成骨向分化，两者的协同作用大大提高体内牙周组织再生能力。Xie等[24]在多相支架的内核中使用聚乙烯亚胺作为阳离子非病毒载体，借助其毒性小、抗原性好、插入性致癌风险低等优点，携带BMP-2质粒，体外实验显示：该材料对人牙周膜干细胞具有极高的转染效率，可以调控其成骨分化。综上，多相支架材料可以作为良好的生长因子传递系统，实现其靶向、可控、有序地释放，也能够与基因治疗结合，极大提升了牙周复杂再生效果。

3 多相支架结合干细胞技术用于牙周组织再生

具有自我更新和分化能力的干细胞以及各种功能细胞是组织工程技术的关键，然而体外细胞培养与支架的简单组合并不能满足复杂牙周多组织再生的需求[25]。多相支架作为一种具备区域特异性的细胞负载材料，有望突破现有细胞治疗的局限。Wu等[26]将牙龈干细胞作为种子细胞，制备组织工程牙周膜/矿化膜构成的“三明治样”多相复合体，结果证实：该复合体不仅可以修复犬前磨牙根分叉区的牙槽骨和牙骨质，新生的牙周纤维还呈45°斜向有序穿行其中，提示牙周功能得到重建。Requicha等[27]将犬来源的脂肪干细胞接种于多相支架上，其中导电纺丝纤维网状层作为外层膜相，其表面形貌可以促进脂肪干细胞的黏附与增殖，抑制上皮细胞迁移，发挥阻碍上皮组织长入缺损区的物理屏障作用；而内层骨相则经过硅醇基团功能化处理，促进了干细胞的成骨分化，加速了新骨形成。

除细胞自身性能以外，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等微环境也在一定程度上影响干细胞功能。多相支架在模拟牙周多组织ECM微环境方面具有显著优势，各相结构可以激发并调控干细胞向不同方向分化，促进多组织复杂再生。有研究[28]制备的多相支架高度模拟了牙周干细胞ECM的天然蛋白和超微结构，证实该多相支架的牙本质基质相与牙髓细胞外基质相分别调控干细胞成牙周向与成骨向分化，最终新生的牙周组织与天然结构高度相似，且支架中的定向纺丝结构引导了新生细胞的有序排列，即实现了牙周组织结构及功能的复杂再生。

在干细胞组织工程中，细胞片技术虽然突破了传统组织工程技术限制，但也存在植入后强度不足、血管形成困难、细胞活性下降等问题[29-30]。Iwata等[31]的研究提示植入细胞片的明显移位可能是阻碍牙周复合体再生的原因之一。细胞片与多相支架的结合能够顺利解决这些问题。Vaquette等[32]构建了一种多相支架，通过牙周膜相负载多层牙周膜细胞片，细胞活性和稳定性都得到了大大提升，牙周纤维再生效能显著。Costa等[33]对这种多相支架进行磷酸钙（calcium phosphate，CaP）涂层处理，使其成骨性也得到进一步提升，同时连通各相的微通道引导了贯穿整个多相支架的血管网的形成，进而保证了细胞片的长期活性，实现了更好的再生效果。综上，多相支架能够负载牙周再生所需干细胞并模拟其ECM，以更大程度地发挥牙周干细胞的再生潜能。多相支架与细胞片的结合，能保证细胞片植入后的生物力学稳定性和强度；其多孔结构也为细胞相互作用和血管的形成提供有利条件。与单一支架相比，多相支架明显加快了新附着形成和重建的进程。

4 多相支架可以改良和提升现有牙周治疗策略

局部感染是重要的牙周致病因素，也是牙周治疗困难、易复发的主要原因之一，给国民经济和卫生保健都带来了沉重负担[34]。局部载药的生物材料可将药物分子直接送到所需部位，并能够在较长时间内持续释放以实现更好的疗效[35-36]，其中多相支架作为局部载药系统之一，具有药物选择面广、负载简单、释放速度可控等优点。Ranjbar-Mohammadi等[37]通过改变支架的成分与内部结构，可以调控牙周常见抗菌药物——盐酸四环素的释放速率，最久缓释长达75 d，体外实验表现出优异且持久的抗菌性能。Chen等[38]的研究使用芯鞘双相的纳米纤维，在负载牙周抗感染药物的同时加载功能化修饰的蛋白因子，实现了抗感染和促进修复的双重效应。

多相支架还可以满足同一载药系统中多种药物的非同步释放。Guo等[39]运用热诱导相分离技术，制备负载有2种药物的三维多功能支架，其中抗炎药物在初始阶段快速释放，短期内有效控制炎症，促成骨药物则后期持续释放以保证后期成骨重塑。大鼠牙周缺损再生结果显示该多相支架的抗炎活性和成骨效能协同促进了牙周再生[39]。

除此之外，引导组织再生术（guided tissue regeneration，GTR）作为当前主要的牙周治疗手段[40]，其空间维持及组织屏障性能均可以通过多相支架实现进一步提升。Carlo Reis等[41]以骨传导性PLGA/CaP材料为内相，其多孔性结构有利于血凝块滞留和血管的形成，为后期骨再生提供充足血供；CaP薄膜为外相，发挥组织屏障作用，阻碍上皮细胞长入。该GTR多相支架在犬Ⅱ类根分叉缺损修复中表现出良好的牙周再生作用。由此可见，多相支架可以辅助改良现有的牙周治疗手段，提升疗效与预后，具有强大的临床应用前景。

5 多相支架结合多种新兴材料技术

牙周炎引发的骨缺陷程度随着疾病发展进程而变化，差异较大，从患牙局部的角形吸收到全口广泛的水平吸收，这就对牙周再生支架的尺寸精确性提出更高要求。3D打印技术是近年来推动再生领域的重大创新之一，可以更快、更精确地实现个性化仿生结构的开发[42]。Park等[43]利用3D打印技术调控牙周膜相和骨相蜡模的宏观尺寸以适应牙周骨缺损空间，具备良好的临床应用前景。3D打印还可以精确控制多相支架内部微观结构。Lee等[20]为模拟牙骨质、牙槽骨和牙周膜的天然致密度结构的差异，打印出微通道直径分别为100、300、600 μm的各相。Park等[43]使用3D打印在牙周膜相界面上设计了多个垂直牙根面的微通道，以此引导细胞增殖和纤维组织浸润方向，最终实现牙周纤维定向排列及功能的再生。

多相支架还可以结合表面微图案化处理技术，以调控细胞黏附、迁移、排列、分化及胞内信号的表达。Pilipchuk等[44]研究证实：使用微图案化聚己内酯（polycaprolactone，PCL）支架修复再生的牙周膜厚度更接近天然水平，且表达更多的成骨效应，这可能与微图案槽沟为骨传导性骨再生提供更多的锚定位点有关。Pilipchuk等[45]进一步在3D打印骨相支架上运用微图案技术获得牙周膜相，使其具备多孔多相的宏观特征和规律的微图案化特性，体外实验显示该多相支架具有明显的模板特性，引导细胞沿表面微图案延展，促进牙周细胞有序排列及胶原纤维的定向再生。此外，电磁信号在引导干细胞分化行为、成骨细胞激活和后续骨生长调控中均发挥重要作用[46]，但将其与多相支架联合运用于牙周再生的相关研究较少。有研究[47]运用聚合3,4-乙烯二氧噻吩这一导电生物聚合物来赋予双相支架材料良好的导电性，电刺激下可促进牙周干细胞生长、增殖及纤维韧带向分化。Sprio等[48]则在多相支架的骨相层构建铁离子化羟磷灰石的特殊构型，赋予其一定的超顺磁性。该支架与干细胞共培养证实其促进细胞增殖与成骨分化，但其体内再生效果尚待进一步研究。

6 总结与展望

多相支架的开发虽然已经取得了可喜的成绩，但在牙周组织再生中的靶向应用仍有许多关键问题及技术瓶颈需要进一步研究与改良。首先，牙周复合体中的不同组织承受的负荷有一定差异，例如牙骨质、牙槽骨需要承担较大的压力而牙周膜则承担了一定的拉伸力[49]，因此多相支架的各相应具备各异的力学性能以实现优良的生物模拟性，表达更具有区域特异性的组织工程支架作用。其次，多相支架的各相应该有相互连通的微通道结构，用于流动运输营养物质和代谢废物，以实现多种细胞交流传递和新生血管的形成，提升最终的再生效果。再次，有研究[50]证实牙周各组织的生长和重建存在时间上的差异，而支架材料需要在再生组织成熟后才能开始降解以保证修复效果，因此多相支架中各相的成分选择及其降解速率应与牙周再生后期的相应组织的重建和成熟速率相协调。最后，多相支架虽然具有机构成分各异的相层，但是不能忽视其作为一个整体的多种效应。某些处理技术例如层压、烧结[32,51]等可能会产生黏着较弱甚至不渗透的各相界面，导致多相支架丧失了其作为整体时的功能集成效应，因此相与相之间的结合技术还有待进一步研究，以期实现有机结合并且增强其凝聚力，确保其在植入及后续再生过程中结构及功能的长期稳定。

牙周组织再生这一问题从提出至今，虽然取得了令人欣喜的进步，但仍面临着更高的要求与挑战，目前常见的临床治疗策略并不能实现牙周组织结构与功能的复杂再生。多相支架在牙周再生领域的应用，是组织工程科学与口腔医学领域的交叉融合，对生物材料进一步优化并与生长因子、干细胞及药物有机结合使其靶向应用，具有极大的研究意义和应用前景。目前多相支架在牙周组织再生中的应用仍停留在实验研究阶段，还有很多方面有待进一步研究与完善。以临床问题为导向、疾病为靶点，有望优化多相支架设计及其作用机制探索，对牙周组织再生、牙周治疗以及组织工程领域的发展均具有重要意义。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。