基于网络药理学的“海藻-昆布”治疗甲状腺肿的作用机制研究

杨甫臣 张世超

辽宁中医药大学附属医院沈本医院骨外科，辽宁本溪 110032

甲状腺肿是指由多种原因引起的甲状腺上皮细胞良性增生导致甲状腺弥漫性或结节性肿大，是临床上甲状腺疾病中的常见病。近年来，随着生活压力不断增大，其发病率不断升高，且女性多于男性[1]。中药治疗甲状腺疾病历史悠久且具有很好的效果。《本草备要》[2]中记载：“海藻，泻热、软坚痰、消瘿瘤；昆布，功同海藻而少滑，性雄。治水肿瘿瘤。”海藻归肝、胃、肾经，具有软坚散结、消痰、利水的作用。昆布归肝、胃、肾经，具有同海藻同样的功效。临床上海藻、昆布两味中药常相互配伍加减，用于治疗甲状腺类疾病[3-5]。

网络药理学是一门在多向药理学理论和系统生物学理论基础上分析药物治疗疾病的系统网络，筛选相关的信号节点，推测药物的成分、靶点蛋白、代谢通路等的学科[6]。网络药理学能全面系统地从多角度揭示药物对疾病的作用机制[7]。本研究基于网络药理学研究方法，从成分、靶点、通路等多角度探讨海藻、昆布治疗甲状腺肿的作用机制，为后续研究的开展提供新思路与依据。

1 材料与方法

1.1 海藻、昆布化学成分及靶点的获取

为了获得海藻、昆布两味中药的化学成分，检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp），并以“口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 以及半衰期（HL）≥4 h”作为筛选条件，选取同时满足以上条件的作为其主要活性成分。TCMSP 数据库包含了500 味中药，中药成分化合物总计30 069 个，并针对每个化合物提供了OB、DL、药物HL 等性质评价数据[8]。接着，检索PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），得到其化学结构以及Smiles 格式。同时通过Swiss Target Prediction 数据库（http：//www.swiss-target-prediction.ch/）获得主要活性成分所对应的相关靶点。通过Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org/）统一靶点蛋白的名称，从而得到海藻、昆布两味中药的作用靶点。并将其结果上传至Cytoscape 软件，绘制海藻-昆布的主要活性化合物及作用靶点网络图。

1.2 中药-甲状腺肿相关靶点的搜集与筛选

为了获得甲状腺肿的相关疾病靶点，应用Dis GeNET（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）、OMIM（http：//www.omim.org/）及GeneCards（http：//www.genecards.org/）3 个数据库进行检索，合并结果，去除假阳性和重复值，得到疾病相关靶点。将海藻、昆布成分作用靶点和甲状腺肿相关的疾病靶点利用R 软件（https：//cran.r-project.org/mirrors.html）进行映射构建韦恩图，筛选出中药-疾病的共同靶点。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建与核心靶点筛选

应用String 数据库（https：//string-db.org/）对上述筛选得到的共同靶点构建PPI 网络模型，其中种类设为“Homo sapiens”，“highest confidence”＞0.9，构建PPI网络，并下载保存TSV 格式文件。同时导入Cytoscape软件中，基于Network Analyse 功能分析其网络。并筛选节点度值（Degree）分布和介数中心性（Betweenness centrality）均在中位数以上的作为“核心靶点”。Degree和Betweenness centrality 是判断网络节点重要性的拓扑参数，其值与节点的重要性成正比。

1.4 GO-BP 生物功能注释及KEGG 通路分析

利用Metascape 软件（http：//metascape.org/，version 3.0）对上述得到的核心靶点进行GO-BP 生物功能和KEGG Pathway 富集分析，将研究物种设置为“Homo sapiens”，以此获得海藻、昆布治疗甲状腺肿的生物学功能及KEGG 信号通路。将靶点基因、GO-BP 生物功能、KEGG 信号通路导入Cytoscape 软件，绘制核心靶点-生物功能-信号通路图。

2 结果

2.1 海藻-昆布主要活性化合物及靶点的筛选

通过在TCMSP 数据库中检索并筛选中药的活性成分，共收集得到活性化合物海藻4 个、昆布6 个。将其Smiles 格式上传到Swiss Target Prediction，筛选出作用靶点海藻225 个、昆布145 个。通过汇总两味中药的作用靶点并删除重复值，最终得到两味药共有靶点305 个。应用Cytoscape 软件绘制海藻-昆布的主要活性化合物及作用靶点网络图。见图1。

2.2 中药与甲状腺肿共同作用靶点

通过检索DisGeNET、OMIM 及GeneCards 数据库获得1162 个甲状腺肿的相关靶点。将305 个中药的共有作用靶点与1162 个甲状腺肿相关靶点输入R软件绘制韦恩图，取交集后获得中药与疾病共同作用靶点70 个。见图2。

2.3 PPI 网络与核心靶点分析

利用String 数据库构建上述共同作用靶点的PPI网络图，见图3。图中共有节点70 个，边119 条。通过Cytoscape 软件对网络中所有节点的拓扑参数（Degree和Betweenness centrality）进行分析筛选，即Degree≥4，Betweenness centrality≥3.30×10-3。共得到核心靶点25 个，包括磷脂酰肌醇3-激酶1（PIK3R1）、p53 基因（TP53）、丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、淀粉样蛋白前体蛋白（APP）、转甲状腺素蛋白（TTR）等。

图2 中药与疾病共同作用靶点韦恩图

2.4 核心靶点生物功能富集分析与KEGG 通路分析

将筛选出的中药-疾病核心靶点导入Metascape软件分别进行GO-BP 生物学功能和KEGG 通路富集分析。结果显示，海藻、昆布两味中药主要通过调控细胞蛋白定位、细胞有丝分裂周期的G1/S 转变、氮化合物的合成、激素刺激和酸性化学物质的反应及MAPK级联和蛋白激酶B 信号传导等生物学过程，以及p53、黏着斑、白细胞跨内皮迁移、神经营养蛋白、ErbB、VEGF、Jak-STAT 等信号通路发挥治疗甲状腺肿的作用。见图4 和图5。并通过Cytoscape 软件构建核心靶点-生物功能-信号通路网络图。见图6。

3 讨论

中医理论中并无甲状腺肿疾病的概念，根据主要临床特征，认为其属于“瘿病”范畴。《外科真诠》云：“瘿瘤多外因六邪，营卫气血凝郁。”[9]中医认为气滞、痰凝、血瘀结于颈部是本病的基本病机，多采用理气化痰、消瘿散结的方法进行治疗，如海藻玉壶汤、消瘰丸等，其方中均含有海藻、昆布两味中药。《神农本草经》中首次提出应用含碘中药海藻用于治疗本病，海藻中含有多糖、脂肪酸等多种活性成分，在《神农本草经》中首次提出应用其可治疗瘿病[10-11]。现代药理学研究表明其具有抗菌抗炎、抗肿瘤和抗氧化的作用[12-13]。昆布主要活性成分昆布多糖、多酚、蛋白质及纤维素等，具有调血脂、降血糖和血压、抗氧化、抗肿瘤等多种药理学作用[14-16]。《嘉佑本草》中论述昆布的功效可以“去瘿行水，下气化痰”。目前临床研究发现，海藻、昆布加减治疗甲状腺结节具有很好的效果。

图3 海藻-昆布治疗甲状腺肿的PPI 网络

图4 海藻-昆布治疗甲状腺肿的GO-BP 生物学功能

图5 海藻-昆布治疗甲状腺肿的KEGG 信号通路

本研究筛选得到海藻活性成分包括二甘醇二苯甲酸酯、异岩藻糖甾醇、β-谷甾醇等；昆布活性成分包括24-亚甲基胆甾醇、花生四烯酸、岩藻甾醇等，并得到海藻作用靶点225 个、昆布145 个，与甲状腺肿靶点取交集后得到共有靶点70 个。通过构建PPI 网络以筛选得到25 个核心靶点，包括TP53、PIK3R1、AKT1、APP、TTR 等。p53 基因是一种细胞生长的重要调节因子，具有在DNA 复制水平上调节细胞正常生长的功能。沈育锋等[17]研究发现，其在结节性甲状腺肿合并甲状腺癌患者中的表达明显增加，是一种特异性标志。PIK3R1、AKT1 是PI3K/AKT 信号通路的重要组成部分，具有调控细胞增殖与凋亡的作用，同时可以加速细胞周期，促进细胞增殖并抑制凋亡。目前多项研究发现，PI3K/AKT 信号通路在甲状腺肿病变中异常激活[18-19]。APP 是一种淀粉样蛋白前体蛋白基因，其与血清三碘甲腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）的表达密切相关，在APP/PS1 转基因小鼠体内，血清T4水平升高，而T3水平下降[20]。而TTR 蛋白主要在肝脏中合成，具有转运甲状腺素的作用。

GO-BP 生物学功能富集分析结果显示，海藻、昆布两味中药主要通过调控细胞蛋白定位、细胞有丝分裂周期的G1/S 转变、氮化合物的合成、激素刺激和酸性化学物质的反应以及MAPK 级联和蛋白激酶B 信号传导等生物学过程发挥作用。KEGG 通路富集分析结果显示，其主要通过p53、黏着斑、白细胞跨内皮迁移、神经营养蛋白信号、ErbB、VEGF、Jak-STAT 等信号通路发挥作用。已有研究表明，甲状腺激素可通过激活p53、MAPK 等从而调控其下游基因表达[21]。VEGF信号通路可调节生理性及病理性血管生成过程，诱导内皮细胞的增殖、分裂和迁移，促进新血管的生成，修复病变血管内膜。VEGF 主要在甲状腺滤泡细胞内合成。目前多项研究表明，在甲状腺肿患者的甲状腺组织及血清中VEGF 均有较高水平的表达[22-24]。Jak-STAT 信号通路可调节细胞因子信号转导，其主要参与介导人体缺氧、缺血以及氧化应激等多种应激反应。有研究发现，高甲状腺激素可激活Jak-STAT 信号通路，从而进一步发挥其作用[25-26]。

图6 海藻-昆布治疗甲状腺肿的核心靶点-GO-BP 生物功能-KEGG 信号通路互作网络图

本研究通过网络药理学的研究方法初步阐明了海藻及昆布从多成分、多靶点、多通路治疗甲状腺肿的作用机制，为其今后研究提供思路和依据。鉴于网络药理学技术的局限性，后期仍需要相应的实验研究加以验证。