血清CA153、miR-10b 在早期乳腺癌诊断中的价值

程 文 潘广锐 曾安贵 王 毅 李 攀

1.攀枝花学院附属医院 攀枝花市中西医结合医院甲状腺乳腺外科，四川攀枝花 617067；2.西南医科大学附属医院康健城院区乳腺外科，四川泸州 646000

2018 年全球乳腺癌发病率和死亡率分别排在第二位和第四位[1]，近年来乳腺癌的发病率和死亡率逐年增长，严重影响人们的生命健康[2]。乳腺癌早期症状不典型，仅有25%的患者处于Ⅰ期时被发现，而约70%的患者到晚期才被确诊，因此提高早期乳腺癌的检出率尤为重要[3]。糖类抗原153（CA153）是一种血型抗原，在卵巢癌和肝癌患者中CA153 高表达，且与肿瘤侵袭和转移密切相关[4-5]。微小RNA（miR）是一类短链RNA，其能够调节肿瘤转移、增殖和化疗药物耐药性等，在肿瘤诊断中的临床价值逐渐得到重视[6-8]。其中微小RNA-10b（miR-10b）在正常组织中低表达，研究报道显示，在肝癌和宫颈癌等肿瘤当中miR-10b 表达量上调，并且与肿瘤细胞的转移和增殖密切相关[9-10]。目前对于CA153、miR-10b 在早期乳腺癌中的作用仍然缺乏了解，本研究检测血清CA153、miR-10b 水平，旨在探讨其在早期乳腺癌患者中的水平及其与临床病理参数间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018 年2 月—2020 年2 月攀枝花学院附属医院（以下简称“我院”）诊治的79 例早期乳腺癌患者作为研究对象，并将其纳入乳腺癌组。纳入标准：①经病理学诊断确诊为乳腺癌[11]；②TNM 分期为0 期和Ⅰ期；③临床资料完整；④行乳腺癌根治术治疗。排除标准：①合并其他类型肿瘤；②存在严重肝肾功能损伤；③入院前接受过放化疗治疗；④存在远端转移者。乳腺癌组年龄35～65 岁，平均（53.71±18.26）岁；雌激素受体（ER）阳性59 例，ER 阴性20 例；孕激素受体（PR）阳性62 例，PR 阴性17 例；人表皮生长因子受体2（HER2）阳性57 例，HER2 阴性22 例；49 例绝经，30 例未绝经；40 例肿瘤直径≤3 cm，39 例肿瘤直径＞3 cm；低分化患者20 例，高中分化患者59 例；TNM 分期0 期患者44 例，TNM 分期Ⅰ期患者35 例。选择同期于我院进行健康体检的42 名健康体检者作为对照组，年龄37～66 岁，平均（54.02±17.89）岁；25 名绝经，17 名未绝经。两组年龄和月经状态比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。临床研究开展均与患者和体检人员签署知情同意书，临床研究开展经过我院医学伦理委员会审核。

1.2 方法

1.2.1 血清CA153 水平检测 研究对象入院后抽取3 mL空腹静脉血，室温静置1 h，5000 r/min 离心20 min，离心半径12.5 cm。收集血清冻存于-80℃。采用酶联免疫吸附法检测血清CA153 水平，使用CA153 检测试剂盒（美国Abcam 科技有限公司，货号ab108633）检测血清CA153 水平，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 血清miR-10b 表达水平检测 使用血清总RNA 提取试剂盒（miR-Neasy Serum/Plasma Kit）和RNA 转录试剂盒（miScript ⅡRT Kit）完成总RNA 的提取和反转录（均购自于德国凯杰公司），具体流程：将血清样本2 mL 与Trizol 溶液充分混匀后室温下静置5 min，加入氯仿0.2 mL 振荡以提取总RNA。采用Agilents RNA LabChip Bioanalyzer 仪（ARLC&2100B，购自美国Agilent 公司）验纯后反转录合成cDNA，设计反转录体系20 μL：RNA 1 μg，2×RT mix 12 μL、Random hexamers 1 μL，最后加入RNase Free H2O 5 μL；反应条件：25℃持续时间5 min，50℃持续时间15 min，85℃持续时间5 min。U6 为内参基因，上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-10b 上游引物序列：5’-CGCACAAATTCGGATCTACA-3’，下游引物序列：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-10b、U6 引物序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。于7500 型实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）上进行PCR 扩增：SYBR Taq Ⅱ10 μL，ROX Dye Ⅱ0.4 μL，U6 primer 1.6 μL，cDNA 2 μL，RNase Free H2O 6 μL；扩增条件：95℃持续10 s 变性，然后95℃持续5 s，60℃持续20 s，95℃持续1 min，共40 个循环；每个样本均设3 个复孔后取平均值。miR-10b 相对表达量采用2-△△Ct表示，△Ct（miR-10b）=Ct（miR-10b）-Ct（U6），△△Ct=△Ct（miR-10b）-△Ct（校准标本）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（）表示，采用独立样本t 检验；计数资料组间比较采用χ2检验；采用受试者工作特征曲线（ROC）分析血清CA153、miR-10b 水平对早期乳腺癌的诊断价值。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象血清CA153、miR-10b 水平比较

乳腺癌组血清CA153、miR-10b 水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 两组研究对象血清CA153、miR-10b 水平比较（）

表1 两组研究对象血清CA153、miR-10b 水平比较（）

注：CA153：糖类抗原153；miR-10b：微小RNA-10b

2.2 乳腺癌组患者血清CA153、miR-10b 水平与临床病理参数的关系

不同ER、组织学分化及TNM 分期乳腺癌患者血清CA153 水平比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。不同HER2、TNM 分期乳腺癌患者血清miR-10b 表达水平比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 乳腺癌组患者血清CA153、miR-10b 水平与临床病理参数的关系（）

表2 乳腺癌组患者血清CA153、miR-10b 水平与临床病理参数的关系（）

注：ER：雌激素受体；PR：孕激素受体；HER2：人表皮生长因子受体2；CA153：糖类抗原153；miR-10b：微小RNA-10b

2.3 血清CA153、miR-10b 对早期乳腺癌的诊断价值分析

CA153 联合miR-10b 诊断早期乳腺癌的曲线下面积（AUC）、敏感度和特异度高于CA153、miR-10b单独检测，具体数据见表3，ROC 曲线见图1。

表3 血清CA153、miR-10b 对早期乳腺癌的诊断价值分析

3 讨论

图1 血清CA153、miR-10b 对早期乳腺癌的诊断价值分析

乳腺癌是较为常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均排在妇科恶性肿瘤首位，对女性健康造成严重影响[12-15]。目前对乳腺癌的发病机制仍然缺乏了解，已有的研究报道显示，肿瘤免疫逃逸、肠道微生物菌群失调、miR 调控机制以及促癌基因活化等因素均会造成乳腺癌的发生，其中miR 调控机制和促癌基因活化在乳腺癌诊断和治疗中的临床价值得到广泛关注[16-17]。寻求与乳腺癌发生、发展密切相关的miR和促癌基因并将其应用于乳腺癌的诊断和治疗中是今后乳腺癌研究的重要方向。

本研究发现，早期乳腺癌患者血清CA153 水平异常升高，且与ER 表达、分化程度和TNM 分期有关。分析其原因可能是由于CA153 能够促进乳腺癌的发生、发展。Liu 等[18]的研究发现，糖基化修饰的CA153能够活化丝氨酸-苏氨酸激酶信号通路，进而促进肿瘤发生、发展。由于丝氨酸-苏氨酸激酶信号通路参与调节肿瘤增殖、细胞周期和肿瘤干细胞维持等过程，因此早期乳腺癌患者在血清CA153 水平升高的同时其糖基化水平升高，糖基化CA153 与肿瘤细胞表面的酪氨酸受体结合，进而活化丝氨酸-苏氨酸激酶信号通路并促进乳腺癌细胞增殖[19]。由于乳腺癌分化程度与乳腺癌细胞增殖相关，因此CA153 促进乳腺癌细胞增殖会导致乳腺癌分化程度下降[20]。同时，黄增光等[21]的研究发现，CA153 与ER 共定位于细胞膜上。CA153 属于黏蛋白家族成员，是一种糖蛋白分子。ER与乳腺癌细胞增殖与细胞周期调控密切相关，ER 阴性的乳腺癌细胞增殖能力异常提高。早期乳腺癌患者中CA153 与ER 结合并抑制ER 活性，进而解除ER 对乳腺癌细胞增殖的抑制效应，导致乳腺癌细胞增殖能力异常提高[22]。

进一步研究发现，早期乳腺癌患者血清miR-10b表达水平异常升高，且在HER2 阴性和TNM 分期Ⅰ期患者中表达水平异常升高。分析其原因可能是由于miR-10b能够作用于抑癌基因的信使RNA，唐静等[23]的研究发现，在结直肠癌中Kruppel 样因子4（KLF4）抑癌基因是miR-10b 直接作用靶点，miR-10b 与KLF4 信使RNA 结合并诱导其降解，导致KLF4 基因表达下调，因此在乳腺癌中miR-10b 能够抑制抑癌基因的表达，阻断抑癌基因对乳腺癌发生、发展的抑制作用，导致乳腺癌恶化[24]。HER2 阴性的乳腺癌细胞恶性程度较高，患者的预后较差。miR-10b 的作用机制主要包括两个方面：一个方面，miR-10b 可以直接与信使RNA结合调节基因转录后修饰，进而调节基因表达；miR-10b抑制转录复合体的形成以调节基因转录[25-26]，因此在早期乳腺癌患者中miR-10b 可能与HER2 基因的信使RNA 结合而促进其降解，使HER2 表达下调。另一个方面，miR-10b 可能会抑制转录复合体形成，导致HER2 基因的转录无法完成，最终导致HER2 表达下调[27]。目前对miR-10b 调节HER2 表达的分子机制仍然缺乏了解，需要进一步深入探究。

本研究还发现，CA153 联合miR-10b 诊断早期乳腺癌的临床价值高于CA153、miR-10b 单独检测，分析其原因可能是由于CA153 和miR-10b 并不是乳腺癌的特征性标志物，在其他类型肿瘤中均能够检测到CA153 和miR-10b 异常表达，因此将CA153 和miR-10b 联合诊断能够有效提高其特异性，对早期乳腺癌的诊断价值也随之提高。

综上所述，早期乳腺癌患者血清CA153、miR-10b水平异常升高，血清CA153 与ER 表达、分化程度和TNM 分期有关，血清miR-10b 与HER2 表达和TNM分期有关，两者联合检测在早期乳腺癌的诊断中具有一定临床价值。