中药促骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

李 姣，黄委委，陶 林，张 磊，杨 锋

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712046；3.陕西高校青年创新团队，陕西 咸阳 712046）

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs) 作为骨髓中的多能干细胞，在一定的诱导条件下能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等成熟细胞，其多向分化的潜能在连续传代培养或冷藏后未受明显影响，是目前发现的较为理想的种子细胞，在组织工程、再生医学领域有着良好的应用前景。通过近些年对BMSCs 的研究，发现其在治疗慢性骨科疾病，以及骨伤后的修复重建的优势愈发明显。大量研究选用中药作为诱导剂，较之以往应用的化学物质和细胞因子，能选择的作用靶点更广泛，且更加廉价实用。通过这些研究发现，中药、中药复方及其有效成分能够显著促进BMSCs 向成骨分化，为临床应用中药治疗骨缺损性及其他骨科疾病提供了科学依据。本文特从单味中药、中药复方、中成药及有效成分促BMSCs 成骨分化及其机制进行综述。

1 单味中药对BMSCs 成骨分化的作用与机制分析

许多中药及其有效成分（如含药血清、醇提物、水提物等），均能对BMSCs 的成骨分化起着积极作用。其中一些药物可提高成骨细胞增殖，或降低、或抑制破骨细胞生成，或具有双向调节的作用。

1.1 淫羊藿 淫羊藿作为传统补肾中药，具有温补肾阳、强壮筋骨的作用。李智奎等[1]通过采用不同浓度的淫羊藿苷对SD 大鼠分子机制进行研究，认为淫羊藿苷通过激活Wnt/β-catenin 信号通路，促进成骨分化相关基因核心结合蛋白因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和成骨功能基因骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达，或是对过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、降脂蛋白（Adipsin）和脂肪酸结合蛋白（FABP4）的表达进行抑制，从而促进了大鼠BMSCs成骨分化，并对其成脂分化也有抑制作用。陈花英等[2]研究发现淫羊藿苷能上调高糖环境下的骨钙素、骨桥蛋白和Ⅰ型胶原基因表达，通过抑制BMSCs 的凋亡进而促进成骨分化，且能对高糖环境下骨损伤的预后有所改善。

1.2 骨碎补 骨碎补为骨伤科常用中药，具有补肾、活血、续伤、强骨的功效。其含药血清、醇提液以及黄酮类物质（主要包括柚皮苷和新北美圣草苷）都具有一定的抗骨质疏松活性。陈云刚等[3]研究发现不同剂量（中等剂量为佳）骨碎补含药血清通过激活Wnt/β-catenin 信号通路，能明显上调β-catenin、低密度脂蛋白受体相关蛋白（low-density lipoprotein related proteins 5，LRP5）、Runx2、Osterixm RNA 的表达，下调GSK-3β的表达，提高ALP 的活性，最终实现对BMSCs 成骨分化的促进作用。申意伟等[4]研究发现骨碎补活性成分柚皮苷对BMSCs 的成骨性分化、成骨细胞的增殖和钙化成熟均有良好的促进作用。

1.3 巴戟天 巴戟天为补阳药，具有温补肾阳、强筋健骨的功效。其有效成分包括巴戟天多糖、巴戟天多糖含药血清及其水提取物等。赖满香等[5]研究发现巴戟天多糖能够提高ALP 活性，并增加其矿化结节数，说明巴戟天多糖在一定程度上具有促进大鼠BMSCs 增殖，以及分化为成骨细胞的能力。赖满香等[6]另一组关于巴戟天多糖含药血清的研究发现，其含药血清在这一过程中通过上调核心结合因子ɑ-1（Cbfɑ-1mRNA）的表达，可能是促进BMSCs 向成骨分化的有效机制之一。

1.4 杜仲 杜仲具有补益肝肾、强筋骨之功效。杜仲槲皮素、山奈酚、醇提取物为其主要有效成分。陈林攀等[7]研究杜仲叶提取物槲皮素对SD 大鼠BMSCs增殖的影响及其分子机制进行了研究，结果发现槲皮素对BMSCs 增殖促进作用，认为其机制可能是槲皮素通过激活细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinas，ERK）磷酸化。林奇生等[8]研究杜仲醇提取物可提升BMSCs 内RhoA/ROCK 信号路径ROCK1、RhoA mRNA 表达量，从而促进BMSCs 成骨分化和增殖。赵晶等[9]研究发现杜仲提取物山奈酚可促进成骨细胞增殖，诱导BMSCs 分化为成骨细胞。

1.5 补骨脂 补骨脂是常用的补肾壮阳药，香豆素类物质为其主要有效成分。韩宇等[10]研究不同剂量补骨脂甲素通过调控cAMP/PKA/CREB 信号通路，上调PKA、CREB mRNA 及蛋白表达，促进大鼠BMSCs 成骨分化及增值，其中以补骨脂甲素高剂量组作用效果最优，这说明补骨脂甲素能够促进BMSCs向成骨分化，其主要机制可能是cAMP/PKA/CREB 信号通路的活化所诱导。韩宇等[11]另一研究为补骨脂素可能通过调控Hedgehog 信号通路，促使音猬因子（Ssonic hedgehog，Shh）、Gli 家族锌指蛋白-1（Gli family zinc finger-1，Gli-1mRNA）表达上调，Ptch1mRNA 及蛋白表达下调，而促进大鼠BMSCs 成骨分化及增殖。

1.6 女贞子 女贞子为常用滋阴药，具有滋补肾阴，强腰膝的功效。女贞子主要活性成分是齐墩果酸、熊果酸、红景天苷、苷元酪醇等。研究表明，女贞子通过对信号通路的基因转录激活或抑制，促进成骨细胞分化、增殖，且能抑制破骨细胞的活性，提高骨组织胶原数量[12]。战美等[13]研究的女贞子提取物、20 μg/mL 特女贞苷、女贞苷G13 和油女贞苷，均能提高BMSCs 的ALP 活性，且20 μg/mL 3 种成分使钙化结节数量增加，提高了骨钙素（bone gla protein,BGP）、Runx2 和LRP6mRNA 表达。女贞子提取物及其3 种成分可能通过诱导Wnt/LRP6/β-catenin 通路的激活促进BMSCs 向成骨细胞分化，是发挥抗骨质疏松活性的主要机制。

1.7 黄芪 黄芪作为补药之长，具有补气、生肌、利尿等功效。香豆素、黄酮类、黄芪多糖是其主要有效成分。研究表明，通过维生素D 轴（ⅤD/ⅤDR）对成纤维细胞生长因子23（FGF23）-Klotho 轴的调控作用，能有效改善衰老的BMSCs 活力和骨形成[14]。王磊等[15]研究发现BMSCs 受到X 线辐射后，其向成骨细胞分化的潜能明显受到抑制。提前给予黄芪多糖（50 μg/mL，干预3 d）被X 线辐射进行培养，结果显示BMSCs 向成骨方向分化的潜能得到保护。胡继宏等[16]研究采用适宜浓度的黄芪多糖、黄芪注射液、黄芪甲苷，3 种物质均可促进大鼠BMSCs 增殖。

1.8 其他单味中药 曾建春等[17]发现肉苁蓉对大鼠BMSCs 增殖和诱导其向成骨分化均具有促进作用。时舒曼等[18]研究使用银杏叶提取物对大鼠BMSCs 成骨分化进行干预，发现其具有促进大鼠BMSCs 成骨分化的作用。谢兴文等[19]研究发现，在不同剂量麝香干预下，在细胞胞浆内I 型胶原表达不同，低剂量对BMSCs 成骨诱导分化后表达影响最显著，说明麝香具有促成骨细胞的生成。除此之外，尚有研究表明，葛根素能通过抑制丝（苏）氨酸蛋白酶（serine/threoninekinase,Akt）活化，能对脂多糖诱导的破骨细胞形成和骨丢失有效预防[20]。张海玲等[21]研究发现龟板成分中的S6、S8、S9，通过表达Id1 能促进BMCSs的增殖，而S2、S3 则抑制其增殖，说明在一定条件下，龟板既可促进BMCSs 的增殖，又可抑制BMCSs 使其不过度增殖。

2 中药复方对BMSCs 成骨分化的作用与机制分析

辨证论治自古即是中医辨病、治病的基本原则，中药复方正是以此为基础，辨证审因、遣方用药，对药物有机配伍组合。中药复方在目前临床所进行的实验研究中，主要是采用其含药血清对体外细胞的诱导培养。

2.1 右归丸 高举会等[22]研究采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组细胞中的Shh、12 次跨膜蛋白（Ptched，Ptc）、Gli-1mRNA，证实了右归丸可以通过激活Hedgehog 信号通路Shh、Ptc、Gli-1mRNA 的表达，从而促进BMSCs 向成骨分化。由此可知，右归丸促进BMSCs 向成骨分化，可能是由激活Hedgehog 信号通路中各表达这一重要机制所诱导的。徐强等[23]研究发现采用不同剂量的右归丸含药血清，对BMSCs 中p-Akt、p-mTOR磷酸化水平水平均有不同程度的提高，从而发挥其促进BMSCs 骨向分化的作用。杨锋等[24]研究发现右归丸含药血清对BMSCs 成骨分化具有促进作用，并在一定程度上能抑制BMSCs 成脂分化。

2.2 左归丸 李宇等[25]研究发现左归丸含药血清能够上调转录激活因子（activating transcription factor-4，ATF4）、BGP 和BMP 的蛋白浓度，并且能够诱导BMSCs 向骨细胞分化，从而能够起到防治骨质疏松症的作用。杨锋等[26]研究左归丸含药血清可通过去甲基化的表观遗传调控机制，促进BMSCs 向成骨细胞分化。此过程中发现通过左归丸含药血清可以上调成Runx2、Osterix、BGP 和β-catenin 的表达，而其DNA 甲基化水平则明显下调。由此可知，左归丸可以通过下调成骨基因甲基化率，促进基因的高表达，使BMSCs 向成骨方向分化。陈东阳等[27]研究说明左归丸可以通过G 蛋白偶联受体信号通路，发挥对骨形成蛋白 6（BMP6）及活化因子4（ATF4）的调节作用，从而促进BMSCs 向骨细胞分化。

2.3 补肾活血汤 李新建等[28]所研究的补肾活血汤（药物组成：熟地黄9 g，杜仲3 g，枸杞子3 g，补骨脂9 g，菟丝子10 g，归尾3 g，没药3 g，山茱萸3 g，红花1.5 g，独活3 g，酒制肉苁蓉3 g）防治激素性股骨头缺血坏死的机制研究，发现其含药血清能抑制兔BMSCs 成脂分化，同时具有促进BMSCs 成骨分化，或诱导脂肪细胞转化为成骨细胞。刘亚梅等[29]的研究运用补肾活血汤（组方同上）含药血清干预后，发现处于增值分裂期（S+G2+M 期）的BMSCs 百分率明显增高，说明补肾活血汤含药血清具有促进BMSCs 增殖活性的作用。张倍源[30]的研究通过将补肾活血方水提液稀释到所需浓度，发现能通过下调miR-210 表达，使钙化结节数量增加，从而促进BMSCs 向成骨分化，表明补肾活血中药能有效改变局部骨组织，以及细胞生长的微环境，改善局部微循环、缺血缺氧。

2.4 黄芪散 王芳等[31]研究发现梯度剂量黄芪散（黄芪散是治疗消渴病的古方，源自北宋《圣济总录》由葛根、黄芪、桑白皮3 味药按质量比2:1:1 的比例组成）含药血清能调节OPN、BGP、ALP、成骨分化相关基因核心结合蛋白Runx2 和成脂分化相关基因PPARγ表达，从而促进BMSCs 增殖及成骨分化，研究提示黄芪散含药血清随着剂量的增大，促进BMSCs 更多向成骨方向分化，且减弱成脂分化趋势。

2.5 二仙汤 刘波等[32]研究发现二仙汤（仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归、知母、黄柏）通过改善氧化刺激对成骨细胞骨形成的影响，促进成骨细胞骨形成，其机制可能与二仙汤调节钙离子通道有关。吴琪等[33]研究通过MTT 法检测发现不同剂量二仙汤能明显提高去卵巢骨质疏松大鼠BMSCs 增殖，中等剂量二仙汤的改善作用最为显著，并采用碱性磷酸酶试剂盒测定发现碱性磷酸酶活力、矿化钙结节形成能力均得以提升高。表明二仙汤可能是通过促进BMSCs 的生长，改善其骨向分化能力，促进骨形成，达到对骨质疏松症的防治作用。

2.6 其他中药复方 刘伯龄等[34]研究说明透骨消痛颗粒含药血清通过上调Sox9 的表达，能加速BMSCs向软骨细胞分化。单独使用较跟软骨诱导剂合用效果稍弱，后者更能增强BMSCs 向软骨细胞的分化，且促进Sox9 的表达也更明显，同时还能增加细胞的collagen Ⅱ、collagen X 表达，这可能是其主要机制之一。贾峰等[35]研究亦发现透骨消痛颗粒含药血清可有效促进BMSCs 中Sox9、Collagen Ⅱ和Runx2 转录水平的升高，有效诱导BMSCs 向软骨细胞分化。提示透骨消痛颗粒含药血清可通过升高Sox9 和Runx2 表达水平，参与诱导分化软骨细胞的信号通路过程，且在一定程度上抑制BMSCs 向肥大的软骨细胞分化，而表现为终末细胞表型。邬波等[36]通过体外分离大鼠BMSCs，采用不同剂量复方接骨片和壮骨片含药血清进行培养，以RT-PCR 法检测得知BMP-2、Runx2、ⅤEGF 及Akt mRNA 的表达明显上调，Western blot 法检测得知BMP-2、Runx2、ⅤEGF 及Akt 蛋白的表达也呈增高，说明其含药血清可在BMSCs 体外分化通路中起到协同促进BMSCs 向成骨细胞分化的作用。宋永周等[37]体外分离培养大鼠BMSCs，通过MTT 法检测发现含抗骨增生胶囊含药血清可促进大鼠BMSCs 增殖，以高剂量组效果最为显著。碱性磷酸酶活性测定结果显示，对分泌碱性磷酸酶的促进作用也更好。茜素红染色结果显示高剂量组形成的钙盐结节更大、更致密。由此可知，高剂量组含抗骨增生胶囊血清可显著促进大鼠BMSCs 的增殖和向骨向分化。

3 小结

从以上研究积极探索中药对BMSCs 成骨分化的调控作用的结果得知，单味中药、中药复方及其有效成分对BMSCs 的增殖和向成骨分化均具有一定的促进作用，其中尤以补肾类方药的运用居多。通过观察发现，补肾类中药对BMSCs 向不同细胞分化的促进作用，在一定程度上与中医辨证论治理念相吻合，其中中药复方更能体现这一中医特点。目前，通过一系列对中药促进BMSCs 向成骨分化的研究，使中药中许多药理成分及药理作用被发现，且进一步得到证实，虽然取得的成果颇多，但仍存有一些问题亟待解决：1）年龄的增长，导致BMSCs 增殖分化能力下降，加上其他方面的限制，如伦理因素，BMSCs 本身取材困难、分化不定向等，造成了种子细胞不能在短时间内大量获取，给研究增加了困难；2）中药及中药复方提取物所含成分复杂，为了能更好对调控机制进行研究，仍需对具有诱导分化作用的成分再研究、再确定，含药血清成分更为复杂，目前关于中药及中药复方对含药血清的研究颇多，其制备的标准、操作规程、质控体系都需要进一步完善；3）在临床应用研究过程中，由于首过效应，以及受药物本身生物利用度的影响，通过口服方式在体内的血药浓度，其剂量选择无法达到体外研究标准，尚未发现对骨科疾病防治的相关文献；4）中药作用于BMSCs 成骨分化各个细胞信号通路的分子机制，各信号通路与通路、因子与因子之间是否存在协同与拮抗作用，虽然一些研究结合了药代动力学、转录组学、蛋白组学等，但得到的结论尚不能确定，因此，深入研究中药诱导BMSCs 向成骨分化作用势在必行。比如此过程中是何种有效成分发挥作用，其主要机制通路和作用的靶点等，仍需进一步研究探讨，以便为今后临床应用中药诱导BMSCs 成骨分化治疗骨科疾病提供更多、更可靠的依据。