褪黑素对动物生殖功能的影响

毛梦菌，吴佳俊，高 倩

(衢州市衢江区畜牧兽医站，浙江 衢州 324022)

哺乳动物卵巢中含有大量的腔前卵泡，但是在发育到有腔卵泡前大约99.9%的卵泡都走向闭锁、退化，这无疑是动物繁殖领域内巨大的浪费。卵母细胞是体外受精、胚胎移植、动物克隆和转基因等胚胎生物技术研究和开发不可或缺的材料，然而卵母细胞来源十分匮乏成为其发展的一个制约性因素，无疑腔前卵泡的体外培养技术为其提供了一个有效途径。

目前，在动物卵泡体外培养实验中仅有小鼠的原始卵泡经培养后，卵母细胞发育成熟并获得了活体后代。在哺乳动物的研究中，有报道从腔前卵泡培养后获得的卵母细胞成熟后发育到囊胚期，但是至今还未有获得活体后代的报道，所以在哺乳类动物的卵泡体外培养研究中还有大量的研究工作要做。

褪黑素(MT)在生殖调控中具有重要作用，在人排卵前卵泡液中发现了高水平的褪黑素，提示有可能直接参与卵泡的生殖调控。在小鼠的次级卵泡体外培养中添加不同浓度的褪黑素，在100 μM水平的条件下观察到雄激素和孕激素的合成量增加而雌激素的合成不受影响，试验表明褪黑素在膜细胞类固醇激素合成过程中发挥一定的作用[1]。同样，在猪有腔卵泡培养体系中，在10、50和100 ng/mL浓度的褪黑素以及有无最佳浓度LH的培养基中培养30 h，发现在有无LH的情况下MT都能促进孕激素的产生，在100 ng/mL时促进雄激素的生成，但在LH存在时表现为抑制作用[2]。

体内外实验以及临床应用表明，MT对人肝癌H22细胞、人肺癌NCIH446细胞、人黑色素瘤SBQ细胞等均有明显的抑制作用，主要表现为抑制增殖，促进凋亡。此外还有研究表明，MT可抑制神经系统肿瘤的增殖，促进多种细胞分化及有助于幼稚细胞的分化成熟等[3]。因此，本实验为了探寻更高质量的猪腔前卵泡培养体系，提高卵泡培养质量，也试图探讨褪黑素对卵泡发育的作用，在卵泡培养液中添加不同浓度的褪黑素，观察褪黑素对猪腔前卵泡的体外生长发育以及细胞凋亡水平的影响。

1 褪黑素的生物学特性

褪黑素(melatonin，MT)是主要由松果体分泌的一种神经内分泌激素，分泌具有明显的光周期性变化(昼低夜高)。褪黑素由Lerner在1958年首次在松果体中分离出来，由于其能使一种产生黑色素(melanin)的细胞发亮，因而得名。其化学结构为N-乙酰-5-甲氧基色胺，相对分子质量232.27，熔点116～118 ℃，其纯品为淡黄色叶片状结晶[4]。褪黑素的分子式为C13H16N2O2。其生物合成与年龄具有很大关系，随年龄的增大逐渐下降。褪黑素受体属于G-蛋白偶联受体家族，并被分为MT1、MT2、MT3等三种亚型[5]。

2 褪黑素的分泌、合成与代谢

2.1褪黑素的分泌 哺乳动物松果体是分泌褪黑素的主要器官，除此之外，在脑区其他部位、视网膜、副泪腺、肠道、非脊椎动物(如昆虫和单细胞藻类)体内、许多植物(核桃、香蕉、黄瓜、草莓)均含有褪黑素。褪黑素在松果体细胞合成的过程为：①色氨酸在色氨酸羟化酶(TPH)的作用下转变成5-羟基色氨酸；②经5-羟基色氨酸脱羧酶(5-HT-POC)催化生成5-羟色胺；③在N-乙酰转移酶(NAT)和羟基吲哚氧位甲基转移酶(HIMOT)作用下最终转变成褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)。MT经松果体及其他组织合成后分泌进入血液，并经脉络膜进入脑脊液。在褪黑素合成路径中，NAT是褪黑素合成限速酶，HIMOT是整个合成过程中的关键酶。

2.2褪黑素的合成 哺乳动物的内分泌活动受光照周期的影响。光照信息通过以下途径到达松果体：光照-视交叉-视交叉上核(SCN)-下丘脑室周区和结节区(经后脑顶盖背侧)-脊髓的胸段-脊髓节前交感神经束-颈上神经节-节后交感神经纤维-松果体的实质细胞。5-HT的浓度变化与日节律相反，即白天增多夜间急剧减少。羟基吲哚-氧-甲基转移酶(HIO)是合成其的关键酶，该酶的活性在夜间黑暗条件下比白天高30～50倍。去甲肾上腺素(NE)可以使该酶活化，是通过cAMP而引起的酶蛋白合成增加所致。光照刺激可减少或抑制交感神经(SNS)释放去甲肾上腺素，因此，光的周期性变化通过SNS而使NE的含量也呈现周期性，从而使HIO的活性、5-HT和MT的量都呈现周期性的变化。由此产生的结果是：日周期性变化和季节性周期性变化。动物MT分泌的昼夜、季节变化规律是生物与自然界环境和营养供应变化相适应的一种本能。

2.3褪黑素的代谢 褪黑素的半衰期约为10 min，肝脏是其主要的代谢器官。MT在肝微粒羟化酶的作用下，吲哚环的第6位发生羟基化，形成6-羟基-N-乙酰基-5-甲氧基色胺。所有代谢的褪黑素中，70%～80%与硫酸结合；5%与葡萄糖醛酸结合，经尿排出；20%经脱乙酰基和脱氨基形成5-甲氧基吲哚乙酸；另外有约1%的MT经尿直接排出[6]。

3 褪黑素的作用

MT是一种具有多种功能的光信号因子，同时又是一种自由基清除剂、抗氧化剂和细胞凋亡抑制剂，参与对中枢神经、内分泌、生殖、消化、免疫等系统的调节。具有高亲脂性和部分的亲水性，有高度弥散穿透能力，从而在细胞膜、细胞质和细胞核中都能发挥抗氧化作用。

褪黑素对生殖系统的影响根据动物的种类、生理状况和季节环境的不同表现出促进、抑制或无作用的多重性。经研究证实：MT对人类和长日照动物如牛、鼠类、禽类等的生殖系统具有抑制作用；对于短日照动物如绵羊、鹿等动物表现为促进作用；而对于光不敏感动物则无作用[7-9]。

MT通过两条途径影响生殖系统：一是与卵巢、睾丸和肾上腺细胞的-肾上腺受体结合直接调节性腺激素的合成和分泌，进而控制生殖器官的发育与成熟；另一途径是通过抑制下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴功能来影响生殖系统，在下丘脑水平上调节促性腺激素的分泌[10]。

在人类的研究中表明，血液中高水平的MT伴随着促黄体素(LH)的释放增加[11]。在对妇女进行外源性褪黑素添加处理时可以增加LH释放的脉冲幅度[12],证实MT在调控LH释放中的功能。培养人的颗粒细胞实验表明当用MT处理时LH受体mRNA水平上调[13]。Li等(1997年)在对雄性大鼠的研究中发现MT对促性腺激素释放激素(GnRH)有正性作用。MT对绵羊的GnRH/LH系统有明显的影响作用。当秋季日照逐渐缩短时，MT的分泌逐渐增加，进而导致母羊生殖内分泌活动加强。

MT除对GnRH/LH系统的调控作用外，对催乳素(PRL)的分泌也有显著的影响。将山羊饲养在人工控制的日照时间为16 h的室内，每日在天黑前饲喂MT，连续饲喂23 d后，检测发现血液中PRL含量下降大约50%[14]。

在猪卵泡体外培养实验研究中得出，MT在膜细胞中通过类固醇激素合成酶基因的表达影响性腺激素的生物合成[15]。在体外培养的人颗粒黄体细胞中添加生理浓度的MT(200 pg/mL)能显著增加孕激素的产量[16]。

研究证实在男性的下丘脑视上核、垂体前叶腺结节及睾丸等部位均有MT受体的存在[17]。在对雄性大鼠的研究中发现MT可对GnRH有促进作用，在成年大鼠中给予切除松果体3周后GnRH浓度下降35%，而在注射MT 4 h后，GnRH mRNA的浓度增加了15%，从而表明MT对GnRH基因有激活作用。

MT与PRL、LH、FSH等之间有特殊的关系，对后者具有重要的调节作用。在对短光照、黑暗、致盲仓鼠激素水平的研究表明，垂体分泌的三种激素水平下降，以PRL下降最为明显，特别是在性腺萎缩以前更明显。外源性MT对生殖功能的调节作用与动物的年龄大小、给予褪黑素的时间长短、光照周期及月经周期等因素有关。MT可使卵巢、子宫萎缩，抑制下丘脑促性腺激素释放，延缓未成年动物的性成熟，降低促性腺激素的诱发排卵效应和阻断绒毛膜促性腺激素引起的排卵与子宫增重反应，缩短黄体寿命、降低孕酮含量，其作用的机理有实验研究表明为通过下丘脑-垂体-性腺轴发挥抑制作用[18]。也有文献报道发现了雌性动物卵巢中MT受体的存在，从而说明MT很有可能也可以直接作用于卵巢来发挥作用[19]。

Ianas等首先证实MT是一种抗氧化剂，主要清除羟自由基(-OH)，一分子的MT可以清除二分子的-OH和H2O2[20]。MT除了能直接清除-OH外，还具有比维生素E更有效的清除多聚不饱和脂肪酸(PUFA)氧化过程中产生的过氧化自由基LOO-的作用。MT的高度脂溶性，使其广泛分布于细胞膜中，并能插入细胞膜中脂肪酸的极性头部之间。这种作用被认为是MT保护细胞膜抵抗氧化应激的另一种方式。MT具有膜受体和核受体，因此能与细胞核接近而清除DNA附近的ROS。MT还能通过激活DNA的修复机制，使DNA免遭各种ROS引起的损伤。MT是目前已知的抗氧化作用最强的内源性自由基清除剂，其自由基清除能力是维生素E的2倍、谷胱甘肽的4倍、甘露醇的14倍[21]。

研究表明：MT是一种非酶类抗氧化剂，可以从两个方面发挥抗氧化作用，其分别为：一是可以与自由基结合，阻止自由基氧化的连锁反应；二是减少自由基的产生。

动物机体内伴随着酶促反应和非酶促反应可以产生自由基，后者包括氧自由基、羟自由基、过氧自由基和单氧自由基等。MT可以及时的清除产生的自由基[22]。其清除的机制可能有：1.通过向缺电子自由基供给电子及清除负电子O2-,从而为生物大分子提供有效的抗氧化保护；2.MT代谢产物级联抗氧化作用；3.通过调节抗氧化酶的表达间接发挥抗氧化作用[23]。