基于网络药理学探讨脑出血方治疗脑出血的作用机制

杨子奇，赵德喜

（1.长春中医药大学中医学院，长春 130117；2.长春中医药大学附属医院脑病科，长春 130021）

脑出血（ICH）占全部脑卒中的10%～15%[1-2]，具有发病急，病情重，病死率和致残率较高的特点，预后不良。现代医学对脑出血的治疗一直没有明确的药物支持，2015年AHA/ASA发布的《自发性脑出血诊疗指南》中，对脑出血内科治疗未推荐针对性药物，亦不推荐外科治疗[3]。中医治疗ICH 具有丰富的临证经验，可以提高患者的存活率，降低致残率、病死率，值得深入挖掘。

脑出血属于中医中风病的范畴，其病位在肝，病机属“肝风内动”，多因痰火、饮食、情志因素致病。近代以来，医家对脑髓的认知逐渐清晰，对于中风的病位倾向于脑，其病机为内外因素刺激下导致的脑窍病变，如唐容川提出以下法治疗脑部及目系疾病，以“离经之血即为瘀血”及“瘀血不去新血不生”[4]；张锡纯提出“脑充血”的概念，以大量活血药治疗脑出血，其论述已接近于现代医学对脑出血的病位诊断。国医大师任继学教授总结前人经验，经过广泛深入的研究和观察，原创性地提出了“破血化瘀，泄热醒神，豁痰开窍”的治疗大法，并创立了脑出血方。动物实验表明，脑出血方可能通过抑制MMP-2/MMP-9 蛋白表达，能效降低ICH 后脑水含量，拮抗脑水肿的发生[5]；研究[6]表明，脑出血方可能通过上调脑出血血肿周围损伤组织中BDNF 及受体TrkB 蛋白表达，显著改善脑出血大鼠神经功能缺损。此外，临床证实该方可以促进脑出血急性期血肿吸收，明显改善患者神经功能缺损，提高生活质量[7]。然而，目前脑出血方治疗ICH 的关键作用靶点、信号通路仍未完全明晰，有待进一步的研究。网络药理学以生物系统与药理学为知识框架，能结合多个靶点、生物过程、信号通路等系统分析药物间协同作用[8]，为运用中医整体观念指导下的中药配对应用研究提供参考。本研究利用网络药理学挖掘脑出血方对ICH 干预与影响的相关成分与靶点，从整体探讨药物对ICH 的调控作用，探索中医药治疗ICH 的新靶点与信号通路，为后续研究提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 化学成分的收集与筛选 借助中药系统药理学技术平台（TCMSP）、中医药综合数据库（TCMID 和Batman-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库收集脑出血方各单味药（水蛭、虻虫、生大黄、蒲黄、三七、石菖蒲、瓜蒌、龟板）主要化学成分，并使用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）对其化合物名称和分子结构进行核对。以口服利用度（oral bioavailability,OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，对化合物进行筛选。

1.2 脑出血方靶点、脑出血靶点和脑出血方治疗靶点研究 通过中药系统药理学技术平台（TCMSP）中医药综合数（TCMI）及Batman-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库，检索水蛭、虻虫、大黄、蒲黄、三七、石菖蒲、瓜蒌和龟板的主要化学成分可能作用靶点并整合。以“cerebral hemorrhage”为关键词在OMIM 数据库和Genecards 数据库进行检索，获取全部的脑出血靶点。使用“Venny”将脑出血方靶点与脑出血作用靶点取交集得到重脑出血方治疗靶点，用于后续研究。

1.3 网络构建 将“1.2”中获取的脑出血方治疗靶点上传至String 数据库（https://string-db.org/）对脑出血方治疗靶点蛋白间的相互关系进行分析。物种选择为“Homo sapiens”，并设置条件“minimum required interaction score=0.9”和“hide disconnected nodes in the network”，随后导入输出文件和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图。此外，利用Cytoscape 3.6.2 软件构建药物-化合物-靶点网络，并利用Network Analyzer 进行拓扑分析，根据中介中心度和节点度来度量节点在网络中的重要性。通过药物与化合物及化合物与靶点连接情况，筛选出脑出血方治疗靶点作用于脑出血的关键化合物和靶点，同时结合现有报道文献进行分析。

1.4 基因本体（gene ontology，GO）功能与KEGG 通路富集分析 为进一步阐述脑出血方在生物学角度不同的科学内涵，本研究拟采用DAVID v6.8 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对脑出血方治疗靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。随后分析结果，进行可视化分析。

2 结果

2.1 脑出血方候选化合物的筛选 运用TCMSP、TCMID 和Batman-TCM 数据库检索水蛭、虻虫、大黄、蒲黄、三七、石菖蒲、瓜蒌和龟板，得到化合物成分，设置筛选条件为OB ≥30%，DL ≥0.18，并去掉不同数据中的相同部分，仅保留唯一。经整合后共得到48个活性化合物（不包括重复的化合物），其中水蛭13个、虻虫2个、大黄7个、蒲黄5个、三七7个、石菖蒲3个、瓜蒌9 个和龟板6 个。

2.2 脑出血方靶点、脑出血靶点和脑出血方治疗靶点收集 对筛选出的48 个化合物，通过TCMSP、TCMID 和Batman-TCM 分析平台，检索水蛭、虻虫、大黄、蒲黄、三七、石菖蒲、瓜蒌和龟板的主要化学成分可能作用靶点并整合，共得到705 个靶点。通过对OMIM 和Genecards 数据库，使用“cerebral hemorrhage”作为关键词，整合得到脑出血基因靶点3 605 个。将脑出血相关靶点和脑出血方活性成分靶点分别导入在线工具Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）进行分析，得到341 个靶点，此即为脑出血方与脑出血的共同靶点。

2.3 靶蛋白互作网络 将脑出血方治疗靶点基因导入String 数据库（https://string-db.org/）数据库，设置筛选条件为智人，设置条件“minimum required interaction score=0.9”和“hide disconnected nodes in the network”，保存得到的相应结果文件，得出292 个PPI 网络的基因，筛选排名前10 位的靶点分别是：MAPK1、AKT1、JUN、TNF、RELA、CXCL8、IL6、MAPK8、BDKRB2、PRKCA，提示这些靶点在脑出血方对脑出血的治疗中可能具有重要作用。

2.4 脑出血方药物-化合物-治疗靶点网络构建 通过Cytoscape 来获得脑出血方单味药-化合物-治疗靶点交集，根据中介中心度和节点度来度量节点在网络中的重要性。药物-化合物-靶点网络总共包括397个节点（48 个化合物节点、341 个靶点节点，其中8个单味药节点），依照交集结果，各单位药度值排名为（从大到小）：蒲黄（51）、生大黄（27）、水蛭（13）、瓜蒌（9）、三七（7）、龟板（6）、石菖蒲（3）、虻虫（2）。排名前3 位的化合物为槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic acid）、苯丙氨酸（phenylalanine）；度值排名前5 位的靶点为PTGS1、PGR、PTGS2、PPARG、AR。预测这些关键化合物和靶点在脑出血方对脑出血的治疗调控网络中起着至关重要的作用。

2.5 GO 富集与KEGG 通路富集分析 将341 个脑出血方治疗靶点导入DAVID 6.8 在线数据库进行GO 富集分析，选择人类作为研究物种，筛选条件设置为细胞的组成（cellular component），分子的功能（molecular function），生物的过程（biological process），可获取分析结果。可分析出生物过程主要涉及药物反应、乙醇反应、RNA 聚合酶II 启动子转录正调控、脂多糖反应、缺氧反应等。细胞组成主要涉及细胞外间隙、线粒体、膜筏、胞浆、质膜等方面。分子功能主要涉及酶结合、蛋白质结合、蛋白质异二聚活性、药物结合等。KEGG 富集结果显示主要涉及HIF-1 信号通路、cAMP信号通路、MAPK 信号通路。由此可知脑出血方可能作用于这些通路来达到治疗作用。

3 讨论

脑出血方以《伤寒论》记载的抵挡汤为基础方，以水蛭、大黄为君药，水蛭味苦，咸，平，有小毒，归肝经，有破血逐瘀，通经活络之用，脑出血时形成血肿，水蛭以虫类之躯而入血分，通达脑窍；大黄味苦寒，归肝、脾、胃、大肠、心包经，泄下攻积，泄火解毒，主通行六腑，二药为君，使在上之瘀血下成下行之势，缓脑府之急。蒲黄、虻虫、瓜蒌为臣药，蒲黄味甘平，归肝、心包经，有化瘀、止血、通淋之功效，蒲黄生于水中，引热以下行，现代医学研究[9]证实，其有较强的凝血作用。虻虫味苦，微咸，归肝经，破血通经、逐瘀消癥，与水蛭相比，其作用迅猛，常与水蛭同用，故为臣药。瓜蒌味甘，苦，归肺、胃、大肠经，有清热涤痰，宽胸散结之功效，很多脑出血的患者都有高血压、高脂血症等病史，或平素嗜好肥甘厚味及嗜酒，均为脑出血发生的危险因素，其人多烦乱而热，符合中医论述的“痰火”为病，瓜蒌清热化痰，补活血药之不逮。三七、龟板、菖蒲为佐使药，三七味甘，苦，归肝、胃经，散瘀止血，可以通神。菖蒲味辛、苦，温，归心、胃经，又名九空子，二药可以开窍醒神。龟板味甘、咸，归心、肝、肾经，滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心，因脑出血时，人体气血奔冲，有升无降，龟板镇静、潜敛，又为血肉有情之品，可以补精气以充脑髓。

本研究中，Degree 排名前3 位的单位药为蒲黄、生大黄、水蛭，该结果与现代中医学君臣佐使的配伍原则大致相符，而蒲黄拥有最高的Degree，可能跟研究过程中使用不同的数据库有关。以上结果表明，在药物的配伍过程中应该更加注重生大黄和水蛭的地位，同时蒲黄也予以考虑。

本研究结果显示，脑出血方单味药-化合物-治疗靶点网络中，PTGS1、PGR、PTGS2、PPARG、AR均为重要靶点。目前，环氧化酶抑制剂是针对脑出血后炎症反应的治疗措施之一，Park HK等[10]研究发现，脑出血患者于48 h 内服用抗炎药物塞来昔布具有减轻脑水肿的作用。基于此推测，脑出血方可能通过靶向抑制PTGS1 和PTGS2 发挥治疗脑出血作用，减轻脑水肿。PPI 网络结果表明，MAPK1、AKT1、JUN、TNF、RELA、CXCL8、IL6、MAPK8、BDKRB2、PRKCA 等靶点蛋白Degree 值大于平均值8.6，表明其可能是脑出血方治疗脑出血的重要靶点群。分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）又称细胞外信号调节激酶2（ERK2），是ERK 信号通路中的重要调节因子，也是MAPK 信号通路的重要成员，具有调控细胞的生长与分化和调节炎症与细胞凋亡等应激反应作用[11]。脑出血模型大鼠血肿周围磷酸化ERK1/2 蛋白表达显著增加[12]。此外，郭孝龙[13]研究发现，ERK 可介导AQP4 的不同表达，对实验性脑出血大鼠脑水肿产生影响。以上结果表明脑出血方可能靶向ERK2 并降低其表达，达到减轻脑出血患者脑水肿的目的。综上所述，脑出血方可以靶向多个靶点群，通过多途径、多机制发挥治疗脑出血药理作用。然而，脑出血方单味药-化合物-治疗靶点网络与PPI 网络中的关键靶点并不一致，其不一样的结果可能是由于不同数据库的局限性所造成的，有待进一步研究。

GO 富集结果表明，脑出血方治疗靶点主要涉及药物反应、乙醇反应、细胞外间隙、线粒体、酶结合、蛋白质结合等，表明其治病靶点分布于不同分子组成，结构功能各异。KEGG 通路结果表明，341 个脑出血方治疗靶点主要参于HIF-1信号通路、cAMP信号通路、MAPK 信号通路等。

HIF-1 是一种异源二聚体，主要由HIF-1α 和HIF-1β 两个亚单位组成。其中HIF-1β 为结构亚单位，HIF-1α 是活性亚基，发挥主要功能。动物实验表明，脑出血模型大鼠血清HIF-1α 较对照组表达上升[14]。此外，临床研究[15]证实，HIF-1α 在急性脑出血患者中表达升高，且其升高水平可反应脑出血病情进展及预后[16]。上述结果表明，脑出血方可能通过干预HIF-1 活性亚基发挥治疗作用。

cAMP 是细胞内重要的第二信使，广泛分布于各种体液和生物细胞中，其主要通过激活下游的PKA 而发挥相应的生物效应[17]。研究[18-19]表明，脑出血模型大鼠或脑出血患者cAMP 水平升高，其可能于血脑屏障破坏有关。脑出血方可能通过抑制cAMP表达水平，修复血脑屏障，发挥治疗作用。

MAPK 通路一种典型的三级激酶模式，其可调节细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞病理生理过程。MAPK 主要包括3 个亚族：ERK、JUN 和p38MAPK，其分别对应ERK 信号通路、JUN 信号通路和p38MAPK 信号通路。现代研究表明，ICH 大鼠模型MAPK 相关蛋白（ERK、JUN 和p38MAPK）在病灶周围脑组织表达增加[20]，崔振文[21]发现MAPK 通路可调节脑出血后神经凋亡。MAPK 可通过胞外信号使ERK、JUN 和p38MAPK 发生磷酸化促进表达炎症因子（IL-1β 和TNF-α）的产生，介导脑出血相关病理生理过程[22-23]。研究证实，通过直接减少体内炎性介质（IL-1β 和TNF-α）的表达，可减轻神经功能损伤[24-26]，减轻脑血管疾病后的氧化反应，从而起到脑保护作用[27]。本研究中，IL-1β和TNF-α 均是脑出血方治疗靶点，且均在MAPK 信号通路中富集。基于此，我们推测脑出血方可能通过介导MAPK 信号通路的关键蛋白（ERK、JUN 和p38MAPK）调节IL-1β、TNF-α 的表达水平，进而调节ICH 神经凋亡发挥对脑出血治疗效果。

综上所述，本研究借助网络药理学方法，对脑出血方治疗脑出血的作用机制进行初步理论探讨，研究结果表明脑出血方48 个活性成分对应341 个治疗靶点中，其中MAPK1、AKT1、JUN、TNF 可能为脑出血方治疗脑出血得关键靶点，其可能通过调节HIF-1活性亚基；抑制cAMP 水平，修复血脑屏障；调控MAPK 信号通路参与脑水肿的发生、减轻神经凋亡，抑制ICH 病理过程，为进一步深入探讨脑出血方治疗脑出血提供了理论基础。