骨质疏松中的自噬相关信号通路

邵家豪 李超张贤

1.南京中医药大学，江苏 南京 210023 2.南京中医药大学无锡附属医院，江苏 无锡 214071

骨质疏松症(osteoporosis)在当下人口老龄化问题日趋严重的情况下俨然成为了亟待解决的社会公共健康问题，其最大的特征就是骨量的丢失、骨微观结构的改变。这种改变的产生主要是成骨细胞和破骨细胞功能动态平衡失调使得骨稳态失衡导致的[1]。近年来，大量研究发现自噬在维持成骨细胞和破骨细胞正常生理功能方面具有重要作用，自噬既能够参与到破骨前体细胞向破骨细胞分化时线粒体活性氧的生成[2-3]，又能够促进成骨前体细胞向成骨细胞分化的过程[4]，在对骨质疏松模型大鼠的自噬相关基因Atg7失活研究[5]中发现当自噬的关键启动基因Atg7[6]被失活，即抑制自噬时会导致破骨细胞分化的降低从而导致体外骨吸收的降低，这些都证明了我们自噬与骨质疏松的发生发展具有密不可分的关系。本文就自噬的信号通路在骨质疏松症方面的研究进展进行综述，希望为进一步探究自噬信号通路的内在调控机制，选择适当的干预靶点，充分发挥自噬对成骨、破骨细胞的有利调节作用，为临床上治疗骨质疏松症提供新的思路。

目前已知的关于骨质疏松的相关通路主要集中在Wnt/β-catenin信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路、Notch信号通路、PPAR-γ信号通路等，同样针对骨质疏松症的自噬信号通路研究也是复杂多样的。就目前来看调控自噬的信号通路与参与骨代谢的信号通路并不是完全独立的，相互之间也有着紧密联系，各信号通路上、中、下游之间的传导关系往往也是错综复杂，各条通路之间看似相互平行，实则有可能是交叉重合，看似方向背道而驰，实则却又起着共同的作用，与骨质疏松有关的自噬通路的研究对于整个自噬通路来说可能还只是冰山一角，目前关注较多的主要还是以接下来的通路为主。

1 PI3K/AKt/mTOR信号通路

磷酸酰肌醇3-激酶(phosphatidylinosital-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路是经典的自噬信号通路之一(以下简写成PI3K/Akt/mTOR)，该通路主要是由上、中游信号转导通路PI3K/Akt和下游效应分子mTOR组成，最上游的PI3K分子参与到细胞的存活、生长、代谢、分化的过程并占据重要作用，调节细胞内蛋白分子的活性[7]，是一类相互协作，目标一致的分子大家族，为接下来的所有位于其下游的分子信号转导提供帮助，而AKt作为PI3K的下游效应分子，在整条PI3K/Akt/mTOR信号通路中位于中游位置，起到承上启下的效应作用，受到激活而磷酸化的Akt分子可以影响到位于其下游多个效应分子的活性，进而影响到整个细胞周期的进程、蛋白质合成、自噬整个过程的进行，PI3K/Akt的活动在整个自噬信号通路中的地位相当于一把关键性的“钥匙”。最下游效应分子mTOR是Akt的重要底物，并且mTOR分子归属于PI3K分子大家族，能够接受并且响应各种信号，正因为这一特点，mTOR在整个自噬信号传导通路中充当“集合点”的作用[8]，不仅PI3K/AKt上游信号通路最后都将汇聚到mTOR这一处，其他自噬调控通路的上游通路的信号传导也都将在mTOR这个“集合点”汇合。就目前研究进展来看PI3K/Akt/mTOR信号通路是一条自噬调控过程中已知的明确的对自噬是抑制性的通路，活化后可以用来抑制自噬，保护细胞免受凋亡；相反，抑制该通路可以诱发自噬使细胞进入凋亡流程[9]。

张森等[10]利用抑制剂对成骨细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路进行抑制，发现被抑制信号通路之后成骨细胞中线粒体功能明显下降，这说明PI3K/Akt/mTOR信号通路在维持成骨细胞正常生存中扮演着重要的角色。成骨细胞的主要功能是参与骨的形成，Mukherjee等[11]研究发现在成骨细胞分化和功能的所有阶段都需要Akt活性，成骨分化是一个多步骤的过程，这些步骤中都可能存在Akt的作用靶点，正是这些靶点操控着成骨细胞的分化方向和进程。这些研究都表明PI3K/Akt/mTOR信号通路参与到成骨细胞的分化过程，并且在整个分化过程中，甚至起到了类似于“方向盘”的把控作用。Xi等[12]用大鼠骨质疏松症模型和培养的成骨细胞模型研究PI3K/Akt信号通路，在体内、体外实验的结果都表明PI3K/AKt信号通路可以通过促进成骨细胞的增殖、分化和骨形成来对骨质疏松的发生与发展产生抑制作用。

PI3K不仅对成骨细胞有积极作用，对破骨细胞也有着特殊的作用。Fu等[13]研究表明，在糖皮质激素诱导的骨量丢失的情况中，破骨细胞的自噬过程会出现增强，而PI3K/Akt/mTOR信号通路参与介导了这一过程，甚至在Hall等[14]的实验中发现在PI3K信号通路参与了破骨细胞骨吸收时所需的小泡胞外分泌和皱褶边界膜形成的过程，并且抑制该通路已被证明可以阻止成熟的破骨细胞进行骨吸收。这些实验结果都表明PI3K参与到了破骨细胞生成和发挥功能的过程中。总而言之，PI3K/Akt/mTOR信号通路在成骨细胞和破骨细胞的分化、增殖的过程中起到了不可或缺的作用，破骨细胞对应了骨的吸收，能够消除旧的骨，成骨细胞对应了骨的形成，能够生成新的骨替代被吸收的骨组织，当骨吸收能力超过骨形成能力时，骨的稳态就被打破，出现“入不敷出”的情况，骨质疏松也将紧随其后，只有当二者相辅相成，相互协调平衡，骨稳态方能正常维持，这都有赖于PI3K/Akt/mTOR这条信号通路的正常传导。

2 AMPK/Akt/mTOR信号通路

腺苷单磷酸激活的蛋白激酶(AMPK)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路(以下简称AMPK/Akt/mTOR)主要是与人间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的过程有关。首先，AMPK是一种真核细胞内重要的能量传感系统，负责维持ATP能量产生与消耗之间的平衡，当细胞内的AMP/ ATP比值增加时，AMPK就会开始干预细胞内的能量流动，激活能量的产生途径并且关闭能量的消耗途径来保存细胞内的能量[15-16]。Aleksandar 等[16]的研究发现，即AMPK能够通过早期mTOR抑制介导的自噬和Akt/mTOR信号转导轴的后期激活来控制人间充质干细胞的成骨分化。Zhang等[17]的研究发现在激活AMPK时可以诱导成骨细胞的自噬，在这个过程中LC3B的表达会增高，成骨细胞分化和矿化能力会加强，而细胞外基质的矿化对成骨细胞的功能成熟具有重要意义，并且在使用3-MA抑制成骨细胞自噬过程时，成骨分化相关标志物如Runx2等的表达会有所下降，这说明AMPK的活化能够使自噬对成骨细胞的骨形成的过程产生促进作用[18]。在整个人间充质干细胞的成骨分化过程涉及到的AMPK/AKt/mTOR信号途径与自噬的作用机制是复杂的，按照时间顺序来看，首先是AMPK信号途径中成员的活化以及自噬的诱导，随后才是Akt和mTOR的晚期活化，成骨分化过程的早期是需要AMPK介导的自噬参与，目的是为了使间充质干细胞达到最佳的成骨分化状态，接下来才是Akt进行磷酸化，并通过Akt承上启下的作用在成骨分化的后期来启动自噬负调控因子mTOR的激活开关。及时协调的AMPK依赖性自噬和Akt /mTOR通路的活化在人间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的具有潜在重要性。

3 ERα-AMPK-Sirt1信号通路

沉默信息转录调节因子1(SIRT1)在抑制肿瘤、维持线粒体稳态、能量代谢、细胞衰老以及细胞死亡等多种生物学功能的调控中发挥着重要的作用，杨旭浩[19]在关于SIRT1调控骨质疏松模型大鼠的成骨细胞线粒体自噬中的作用研究发现SIRT1的缺失会导致骨量的减少，而当其基因过表达时会出现骨量的增加，在Kim等[20]相关研究中发现Sirt1 能通过破骨细胞谱系细胞中的直接作用抑制骨吸收。AMPK与Sirt1之间相互作用主要体现在Sirt1可以通过对LKB1分子的去乙酰化修饰来辅助增强AMPK的表达进而引发自噬，相关研究[21]表明，AMPK被抑制后，成骨细胞凋亡数量会增加，再进一步沉默AMPKα后，成骨细胞的凋亡效应更加明显，可见Sirt1 / AMPK 的正常激活对于成骨细胞的存活起到至关重要的作用。总的来说，目前对于ERα/AMPK/Sirt1这条信号通路还是构建在AMPK作为自噬的关键调节因子的基础上，AMPK的激活可以直接诱发自噬的过程，也可以通过抑制mTOR相关表达来间接诱发自噬的产生。对于ERα/AMPK/Sirt1信号通路的研究才刚刚开始，有许多未知在等待我们去探索。

4 ROS信号转导通路

活性氧类(ROS)是一类化学性质活泼、具有较高氧化活性的分子和离子的总称，是需氧细胞代谢过程中产生的活性氧簇，主要包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、一氧化氮等。ROS通过细胞氧化应激反应能够诱导细胞产生凋亡甚至导致细胞的坏死[22]，是氧化应激反应中关键信号分子，并且 ROS 还能在许多信号通路(包括 MAPK 和 NF-κB)的调控中充当第二信使[23]。线粒体既是细胞的能量工厂同时又是ROS产生的主要部位，相关研究[24]表明，ROS作为一种重要的信号分子，可以启动自噬体形成和自噬降解，起到细胞信号分子的作用[25]，参与细胞增殖、分化、凋亡、自噬等多个生理过程，尤其是线粒体来源的ROS，在自噬发生的过程中发挥重要作用，当大量ROS类分子在线粒体内蓄积，可引起线粒体膜脂质过氧化，导致线粒体功能异常，进而诱导自噬产生[26]，当自噬激活后又可通过降解过氧化氢酶更进一步地增加细胞内ROS的水平，最终引起自噬性细胞死亡的不良结果。SIRT3作为一种重要的线粒体蛋白，可通过稳定线粒体膜电位的方式来保持线粒体的正常功能来抑制氧化应激并减少活性氧(ROS)的产生，Gao等[27]研究证明SIRT3/SOD2途径可通过调节线粒体应激来维持成骨细胞分化和骨骼形成。Jin等[28]关于唑来膦酸治疗骨质疏松的相关研究发现，H2O2分子含量变化可诱导成骨分化相关基因表达的下调。同时，H2O2分子的相关变化还会导致骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性和矿化能力的下降，进而影响到骨髓间充质干细胞向成骨分化的过程，王啸等[29]在关于高铁环境下的破骨细胞分化情况的研究中发现在高铁环境下ROS水平升高，能够促进破骨细胞的分化,

5 NF-κB信号通路

NF-κB是哺乳动物体内调控细胞的增殖、分化、炎症过程中的重要转录因子，其能够参与机体的炎症反应、免疫应答及其他应激反应[30]。最新的研究发现，随着衰老的进展，体内糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)会逐渐堆积，而AGEs的堆积可以激活核因子-κB(NF-κB)信号通路并引发氧化应激氧化反应，这种通路机制被认为与组织衰老退化有关。自噬可以通过调控该信号通路，促进成骨分化、提高矿化能力，利于骨形成。在关于NF-κB信号通路的研究[31]中发现，丧失NF-κB信号功能的小鼠会显示出以骨量减少为特征的骨质疏松症。NF-κB激活对于破骨细胞的骨吸收功能至关重要，当细胞受到相关氧化应激反应的炎性物质刺激时，NF-κB 信号转导通路将会被激活，进而促使组织蛋白酶K( cathepsin K，CatK)、抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)等与破骨方面有关的特异性基因的表达有所升高，在宏观上就表现为破骨细胞数量增多，骨吸收能力的增强，骨密度的下降[32]，所以若要纠正骨质疏松过程中破骨细胞强势的情况时，可以考虑抑制该信号通路，如此能够在一定程度上对破骨细胞进行抑制起到纠正破骨细胞与成骨细胞不平衡关系的作用。NF-κB信号通路的受体活化需要p62，具体指p62与TRAF6相互作用并通过非典型蛋白激酶C介导的破骨细胞中IκB激酶(IKK)的活化来激活NF-κB信号通路。此外，NF-κB信号通路可以控制间充质干细胞向成骨分化的过程，NF-κB活性功能的表达能够阻止成骨分化，自噬过程中的p62信号传导可以通过减弱自噬活性进而减弱IκB激酶/核因子-κB(IKK/NF-κB)这条经典NF-κB信号通路的活性表达，反过来促进成骨细胞分化。

p62，也称为sequestosome1，是自噬和泛素-蛋白酶体系统控制泛素化蛋白质更新的主要调节剂，可转运多泛素化蛋白，用于蛋白酶体和溶酶体降解的过程中[33], 充当着自噬适配器的作用，p62能够识别多聚泛素链并与 LC3 相互作用，将选定的货物靶向自噬体，从而开启自噬降解的运转流程。除此功能外，p62还可以在多种信号通路中充当信息的交换中心，包括Nrf2、NF-κB、caspase-8和mTORC1介导的信号传导途径，正因为p62涉及到了多条信号通路，p62这个蛋白能够在控制氧化应激、炎症和细胞存活、细胞凋亡以及代谢重组过程中起到至关重要的作用[34]，在自噬过程中，p62与泛素化的蛋白质结合，再与定位于自噬小体内膜上的LC3-II蛋白形成复合物，一同在自噬溶酶体内降解。因此，当出现自噬时，在细胞质中p62蛋白不断被降解，当自噬出现活性减弱、功能缺陷时，p62蛋白会在细胞质中不断累积，p62是反映自噬活性的标记蛋白之一，因此p62在破骨细胞形成中也起着核心作用。

综上所述，骨质疏松症是一种骨骼代谢平衡失调性疾病，由于骨骼重塑过程中成骨细胞、破骨细胞功能表达的失衡，尤其以破骨细胞介导的骨吸收功能的过度表达导致骨骼质量低下和骨折风险增加，因此目前针对破骨细胞的强势功能表达这一不平衡的情况已经通过开发抗吸收剂来作为骨质疏松症治疗的主要方向[35]，对于自噬在骨质疏松方面相关信号通路的研究主要还是集中在以mTOR为主要“中转站”的信号通路为主，就目前的研究中最为集中也最为深入的是PI3K/Akt/mTOR信号通路，利用这条通路来调控自噬进而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化以及成骨细胞和破骨细胞的生理代谢和功能表达是目前比较清晰的方向。自噬在细胞的损伤机制中起到了类似于“双刃剑”的作用，当从有利的方面来看，自噬是体内平衡的重要调节系统，既可以降解错误折叠起来的蛋白质，又可以选择性地靶向降解受损的细胞器来抑制细胞的凋亡[36]，还可以参与到细胞的凋亡过程[37]，当从不利的方面看，自噬时间延长时，基本稳态和细胞存活所必需的蛋白质和细胞器就会被过度降解，从而导致细胞死亡(自噬细胞死亡或II型程序性细胞死亡，PCD II)，因此，从自噬对细胞降解的程度来看，自噬既是细胞存活机制又是细胞死亡途径[38]。AMPK作为自噬的关键调节因子，如果想要更进一步地把握自噬的机制，AMPK相关信号通路的研究是不可错过的重头戏。AMPK/Akt/mTOR信号通路在调控自噬与成骨分化之间的关系具有复杂的时间依赖性和双向调节性，笔者认为研究成骨过程中早期AMPK依赖性自噬和后期的Akt/mTOR通路活化之间的关系，并且利用这个关系来调控成骨的过程是值得进一步深入研究的方向。