粉防己碱抗肿瘤作用机制的研究进展

尚雯倩，张艾民，付 燕，孔 宁，刘新苑

(1. 山东省淄博市妇幼保健院，山东 淄博 255000；2. 山东理工大学，山东 淄博 255000)

粉防己碱又名汉防己甲素，是一种双苄基异喹啉类生物碱，主要从中药粉防己(Stephania tetrandra S. Moor)根中提取，属于天然产物。其化学结构为 2-羟基-4-甲氧基苯乙酮，分子式为C38H42N2O6，呈无色针状结晶，几乎不溶于水。现代药理研究显示，粉防己碱具有多种生物活性，包括钙通道阻滞剂、抗炎、免疫抑制、抗过敏、抗氧化，抗癌，抗菌等作用[1]。近年来针对粉防己碱抗肿瘤作用的研究越来越多，其对肝癌、肾癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、口腔癌和前列腺癌等[2-9]多种肿瘤均有明显抑制作用。本文主要从以下几个方面，对粉防己碱抗肿瘤作用机制进行综述，以进一步探讨其作为抗肿瘤药物的前景。

1 抑制肿瘤细胞增殖

细胞增殖是细胞物质积累与细胞分裂的循环过程，是通过细胞周期来实现的。肿瘤进展过程中，异常细胞分裂导致的细胞增殖常伴有细胞周期的失调[10]。细胞周期的各个阶段是由周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)和细胞周期蛋白协同控制的。因此，细胞周期蛋白可作为癌症治疗的潜在靶点[11]。

有研究显示粉防己碱可以抑制Huh-7肝癌细胞的增殖，药物作用24 h和48 h后的IC50分别是20.8和8.0 μM[2]。随着粉防己碱浓度的增加，S期和G2期细胞百分率下降，G1期细胞百分率上升。Chen等[3]发现粉防己碱对786-O,769-P和ACHN肾癌细胞系均有抑制作用。其研究表明，粉防己碱可以通过调控细胞周期蛋白p21 WAF1/CIP1和p27(kip1)诱导G1期细胞阻滞。此外，粉防己碱可抑制小鼠血管内皮瘤细胞增殖，通过下调cyclin D、cyclin E和CDKs的表达，使G1/S期细胞阻滞[12]。Wu等[13]研究发现粉防己碱可以通过靶向Wnt/β-catenin通路抑制结肠癌细胞的增殖。进一步研究发现，IGFBP-5参与了结肠癌的发生，外源性的IGFBP-5可以减弱粉防己碱的抗癌作用，但IGFBP-5敲除后粉防己碱的抗癌作用增强。实验数据表明粉防己碱可能是通过将调节IGFBP-5的表达，以抑制Wnt/β-catenin信号通路。

2 诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是受到特定刺激后，细胞发生的程序性死亡的过程[14]。细胞凋亡主要由两种途径引发：一种是死亡配体与死亡受体的结合，另一种是由“线粒体”起始的内源性途径[15]。近年来发现了内质网应激介导的新凋亡途径。诱导凋亡信号分子的失控和促凋亡基因的突变，会引起肿瘤的发生和转移[16]。目前研究报道了粉防己碱通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡。

2.1线粒体途径 当线粒体受到刺激后，会释放凋亡相关因子到细胞质基质中，引发细胞凋亡。常见的凋亡相关因子，如Bcl-2、细胞色素 C、凋亡诱导因子(AIF)、线粒体衍生的第二种半胱天冬酶激活剂(Smac)、高温应激蛋白 A2(HtrA2)、核酸内切酶G等。蛋白酶 caspase是细胞凋亡的效应器，分为凋亡起始者和凋亡执行者。受到外界刺激后，凋亡起始者(如caspase-9)可以激活凋亡执行者(如 caspase-3、7)，从而引发凋亡[17]。Zhang等[18]发现粉防己碱不仅抑制SiHa细胞的增殖，而且在体内可以抑制宫颈癌肿瘤体积和质量的增长。体内外均实验显示粉防己碱可通过上调活化的caspase 3的表达，诱导宫颈癌细胞凋亡。ROS主要由线粒体产生，可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路诱导细胞凋亡[19]。有研究显示粉防己碱可以通过提高ROS的水平，激发促凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-3的表达，以诱导乳腺癌和胰腺癌细胞的凋亡[20]。粉防己碱还可以引起人口腔癌cal27细胞ROS的积累，并促进细胞色素C、AIF、Bax和活化caspase-3, 28, 29的表达，降低Endo G的表达，从而促进细胞凋亡[21]。Tao等[22]实验显示，粉防己碱处理过的U2-OS和MG-63骨肉瘤细胞细胞色素c、Apaf-1、Bax表达增加，Bcl-2、Bcl-xl表达减少。说明粉防己碱可通过线粒体途径诱导骨肉瘤细胞凋亡。

2.2内质网应激途径 内质网是一种重要的细胞器，当内质网内未折叠蛋白、错误折叠蛋白增加或钙离子稳态改变时，可引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)[23]。严重持续的内质网应激，可诱导细胞凋亡，与肿瘤的发生密切相关。内质网应激凋亡通路中的信号分子CHOP/GADD153、Bcl-2、ATF4、JNK、ATF6f、Caspase-12等及凋亡蛋白抑制剂在内质网诱导的细胞凋亡中都起到重要作用[24]。内质网分子伴侣GRP78是UPR的主调节器，具有阻断细胞凋亡的能力，在恶性肿瘤中呈过度表达[25]。Lin等[4]通过对人鼻咽癌NPC-TW 076细胞的研究发现，粉防己碱可引起细胞形态学改变，引发细胞G0/G1期阻滞，增加ROS和Ca2+的产生。Western blot实验显示粉防己碱可以增加内质网应激反应蛋白如GADD153,GRP78,ATF-6α和ATF-6β的表达。另有研究者发现粉防己碱作用NPC-TW 039细胞24 h后GRP78和GADD153蛋白的表达会增加，表明粉防己碱可通过内质网应激反应诱导鼻咽癌细胞死亡[26]。

2.3其他信号转导通路 经典细胞信号通路PI3K/AKT、MAPK、JAK-STAT等与肿瘤生长和凋亡密切相关。Tian等[27]发现粉防己碱可通过激活骨肉瘤143B细胞中的p38 MAPK来上调PTEN，从而发挥抗癌作用。Chen等[28]研究显示，粉防己碱可通过上调TGF-β1，减少PTEN的磷酸化，以抑制PI3K/Akt信号通路，以诱导结肠癌HCT116细胞的凋亡。此外，粉防己碱可以抑制肺癌的生长，通过激活PARP-Akt-Bax和VEGF/HIF-1α/ICAM-1细胞通路，发挥诱导人肺癌A549细胞的凋亡[29]。另有实验显示粉防己碱在体内外均可诱导胶质瘤细胞凋亡[30]。粉防己碱可以减少胶质瘤U87细胞p-STAT3和其下游蛋白Bcl-2、CyclinD1、HIF-α、VEGFA的表达。说明粉防己碱可通过抑制STAT3磷酸化来抑制细胞存活、增殖和肿瘤血管生成，从而抑制胶质瘤的生长。

3 细胞自噬

细胞自噬是受细胞质中细胞成分调节的动态过程，细胞质和细胞内容物被双层膜结构的自噬小体吞没，随后与溶酶体融合，裂解酶降解并循环利用[31]。细胞自噬在细胞生存和死亡之间起到平衡作用[32]。在癌细胞中，自噬具有双重作用，是肿瘤发生和治疗的重要途径[33]。自噬的发生机制涉及多个过程和信号通路。mTOR在细胞自噬中起着门控作用，可与ULK复合体结合使其失活，抑制自噬。Beclin-1是自噬核心复合物中重要的组成部分, 也是自噬能否得以活化的关键, 体外实验表明激活Beclin-1活化自噬可以抑制肿瘤的发生[34]。Beclin1、LC3和p62是自噬的主要参与者，可用于细胞自噬水平的评估。

Guo等[5]实验显示12.8，16.1和25.7 μmol/L浓度的粉防己碱对三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞表现出明显的细胞毒性。粉防己碱通过降低p62/SQSTM1表达，提高Beclin1和LC3-II/LC3-I的表达，抑制PI3K/AKT/mTOR通路(降调p-AKT、ser473/AKT、p-PI3K/PI3K p110α、p-mTORser2448/mTOR和升高PTEN的表达)诱导MDA-MB-231细胞自噬。Wong等[35]将粉防己碱作用于多种细胞系，发现乳腺癌细胞出现自噬潮及自噬小体，进一步实验发现粉防己碱通过mTOR依赖诱导自噬。有研究发现粉防己碱可诱导胃癌细胞的自噬，可以降调自噬相关蛋Beclin-1、LC3-II、p62的表达,减少AKT/mTOR、PS6K和P-4EBP1的磷酸化[36]。当加入自噬抑制剂3-MA或Baf-A1，会增加粉防己素碱加药细胞的活力，证实了自噬在胃癌中的作用。粉防己碱通过诱导Akt/mTOR通路的自噬和凋亡发挥抗肿瘤作用。多位学者研究显示粉防己碱也可以诱导口腔癌细胞的自噬。经粉防己碱处理后，SAS和CAL27细胞LC3-I、LC3-II、Atg-5和beclin-1蛋白的表达水平均升高，用siRNA敲除Atg-5、beclin-1后，与对照组相比，粉防己碱组细胞增殖明显下降。可见在粉防己碱诱导SAS和CAL27细胞自噬中，Atg-5和beclin-1的上调起着关键作用。对于口腔癌HSC-3细胞粉防己碱也是主要通过Beclin-1/LC3-Ⅰ、Ⅱ信号通路诱导其自噬[8]。

4 抑制肿瘤细胞转移和侵袭

肿瘤的转移和侵袭离不开肿瘤血管的生成[38]。据报道，MMPs表达水平的升高与癌细胞血管生成、迁移和侵袭水平的升高有关[39]。常用MMP-2和MMP-9的表达水平评估癌细胞的入侵和迁移。有研究发现经粉防己碱作用的肾癌786-O和769-P细胞Akt、NF-κB、MMP-9蛋白的表达量均显著下降[40]，说明粉防己碱可通过调节Akt/NF-κB/MMP-9信号通路来抑制肾癌在体外的迁移和侵袭。Liu等[41]通过划痕实验和transwell侵袭实验发现粉防己碱可以抑制前列腺癌DU145和PC-3细胞的迁移和侵袭。Juan等[42]发现粉防己碱显著降低了结肠癌SW620细胞的迁移率，10 μM粉防己碱作用24 h和48 h，与对照组相比将抑制迁移率分别提高到176.74和183.45%。Westernblot实验显示粉防己碱可显著降低该细胞系MMP-2、MMP-9、MMP-1和TIMP1蛋白表达水平，并呈浓度依赖性。

5 逆转多药耐药

化疗是癌症治疗的常用方法，但多药耐药严重影响了化疗的疗效。目前常用化疗药如顺铂、卡铂、5-氟尿嘧啶及紫杉醇等，虽然疗效确切，但不良反应多，易产生多药耐药。因此，寻找抗多药耐药的新型药物，是抗癌药物抵抗问题的潜在方向[43]。这些药物与抗癌药物联合作用，通过提高细胞内药物存留，恢复细胞对化疗药物敏感性，以提高抗癌作用。

Ye等[44]研究发现粉防己碱可以提高顺铂耐药细胞A549对顺铂的敏感性，而且粉防己碱与顺铂联合用药，与顺铂单药组比，可更好地抑制肺癌A549细胞的增殖，促进凋亡，诱导自噬。粉防己碱还可在体内外增强顺铂对人卵巢癌细胞的细胞毒性[45]。通过调控Wnt/cadherin信号通路粉防己碱可提高卵巢癌对顺铂的敏感性。Yuan等[46]将亚砷酸盐、粉防己碱及两者联合用药分别作用于MDA-MB-231荷瘤小鼠10周，肿瘤体积与空白组相比分别减少了35.8%，37.2%，51.6%，肿瘤重量联合组也明显轻于单药组。通过说明粉防己碱可以提高亚硫酸盐的体外抗肿瘤活性。此外，粉防己碱还可与紫杉醇、氯喹、蛋白酶抑制剂H89协同提高抗肿瘤作用[47-49]。

6 提高放疗敏感性

放疗是恶性肿瘤的另一种重要治疗方法。抗肿瘤药物不仅可以与其他化疗药物联合作用，还可以配合放疗以增强肿瘤细胞对放射线的敏感性，以增强抗癌效果。Zhao等[50]发现粉防己碱可以增强肝癌细胞HepG2和LM3放疗的敏感性，并且随粉防己碱浓度的增加，敏感性增强。Westernblot实验显示粉防己碱与放疗联合作用组凋亡相关蛋白Bax、caspase-3的表达较单独作用组均明显下降。Wang等[51]将放疗和最大无细胞毒剂量粉防己碱联合处理鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2，细胞的生存率显著降低。两者联合作用可抑制CDK1和CDC25C的磷酸化，增加cyclin B1的表达。说明粉防己碱可通过CDC25C/CDK1/cyclin B1途径增强鼻咽癌细胞的放射敏感性。此外，粉防己碱可通过降低磷酸化ERK及其下游蛋白的表达来提高人脑胶质瘤的放疗敏感性[52]。

7 讨 论

癌症是全球人类死亡的主要原因，随着人口的增长和老龄化，癌症的发病率还会增加，这种趋势在欠发达地区尤其严重[53]。WHO组织预测到2030年，全球癌症死亡人数将达到1 140万[54]。传统抗癌药物常易引起严重胃肠反应、骨髓抑制、肝肾毒性等明显不良反应。天然药物容易获得、不良反应少，可作为抗癌药物研究的重点[55]。

粉防己碱是一种典型的天然药物，目前对粉防己碱抗肿瘤机制的研究，主要集中在抑制增殖，诱导凋亡，引发自噬，抑制迁移和侵入，逆转多药物耐药性及放疗增敏等方面。粉防己碱抗肿瘤分子机制是复杂多样的，既往研究主要针对caspase、PI3K/Akt、MAPK、Wnt/β-catenin等通路及自噬相关蛋白。对其他通路如NF-κB、Notch、JNK等及调控靶点的研究较少，而且对细胞信号通路的研究不够深入，大多未深入研究影响通路的机制。其次，由于癌症的复杂性，涉及多个信号通路，单一化合物很难对抗癌症，可重点研究粉防己碱联合用药或联合治疗等方面。再次，目前的研究主要局限于体外研究，应继续加强体内研究，适当进行一些临床试验。同时需要更多的基于机制的药理学、代谢、药代动力学和毒理学研究。虽然粉防己碱是一种潜在的抗肿瘤药物，但存在生物利用度低的问题。因此，我们应重点加强对递药方式(如合成纳米粒子)或改变粉防己碱分子式(如将其盐化)的研究，以提高生物利用度，才能开发利用，应用于临床。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。