曾张琴 综述,董家书 审校
广西医科大学第四附属医院检验科,广西柳州 545005
由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS),即艾滋病,在全球范围内广泛流行,是一种至今尚无有效疗法的致命性传染病。现有的抗病毒药物虽然在某种程度上可以缓解病情,但AIDS的治疗问题还是没有解决:药物本身的毒性作用与昂贵价格,长期用药导致的耐药病毒株,整合到宿主基因组中的病毒基因等[1-2]。针对传统药物的上述弊端,寻找新的治疗靶点成为HIV药物研究的重要方向[3]。
HIV可分为HIV-1和HIV-2两种亚型,其中HIV-1致病性强,是引起AIDS的主要病原体。HIV-1感染机体免疫细胞除了需要CD4受体外,还需要CC趋化因子受体5(CCR5)或CXC趋化因子受体4(CXCR4)作为辅助受体。HIV侵染机体细胞主要包括3个步骤[4]:病毒包膜糖蛋白gp120与细胞表面蛋白受体CD4结合,病毒吸附在细胞表面;随后病毒gp120再与细胞表面辅助受体CCR5或CXCR4结合,病毒的第2个包膜蛋白gp41暴露出来;最后,病毒的gp41构象发生一系列改变,其N末端片段插入细胞膜,导致病毒包膜与细胞膜发生融合,病毒内容物RNA进入细胞内。HIV-1通过何种途径感染细胞决定于病毒的嗜性。T细胞嗜性的病毒株主要通过CXCR4感染细胞,称为X4嗜性;单核细胞/巨噬细胞嗜性的病毒株主要通过CCR5感染机体细胞,称为R5嗜性;而R5/X4嗜性的病毒既可以通过CCR5也可以通过CXCR4感染细胞。此外,在感染的不同阶段,病毒利用的辅助受体也有所不同。一般在感染早期阶段,病毒主要通过CCR5感染机体细胞,随着病程延长,HIV-1由R5嗜性逐渐向R5/X4双嗜性转变,感染晚期以X4嗜性病毒株占主导,而单一的CXCR4途径一般不会导致机体感染[5]。
2.1CCR5简介 趋化因子是一类具有趋化活性的小分子细胞因子,它能募集细胞表面具有G蛋白耦联受体的细胞聚集在一起,参与机体免疫平衡作用。迄今发现的趋化因子家族共有50多种成分,根据其N-末端2个半胱氨酸残基位置的不同可分为4大类:CXC(或α)、CC(或β)、C(或γ)和CXC3C(或δ)。CCR5是CC亚族趋化因子(RANTES、MIP-α和MIP-β)的受体,主要表达在记忆性T淋巴细胞、单核细胞及未成熟的树突状细胞等细胞膜上,其表达量可被促炎症因子上调[6],具有调控T淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞迁移、增殖及免疫反应的功能。CCR5基因位于人3q21.3上,其mRNA长约3.6 Kb,共编码352个氨基酸,相对分子质量为40.6×103。CCR5具有G蛋白耦联受体家族所特有的呈α螺旋的7个跨膜区(TM),在结构上包括以下几个部分:胞外N-末端、3个胞外环(ECL1-3)、3个胞内环、7个跨膜α螺旋及胞内C-末端。跨膜区的氨基酸具有高度保守性,ECL1和ECL2以二硫键相连,以维持蛋白质二级结构的稳定性,其N-末端和ECL2对于CCR5与HIV的gp120结合起着关键的作用,目前研发的很多CCR5拮抗剂都是针对上述几个位点[7-10]。
对CCR5研究发现,其基因发生多个突变的个体能有效抵抗HIV的感染,其中以编码区CCR5Δ32研究最为广泛[11-13]。CCR5Δ32是指CCR5基因编码区的32个碱基发生缺失突变,即在CCR5等位基因编码第185个氨基酸密码子后的32个碱基发生缺失,导致读码框架错位,ECL3结构缺失,CCR5结构不完整而丧失其辅助受体功能,因此,HIV无法通过gp120与CCR5结合侵袭细胞。CCR5Δ32是在欧洲人群中比较常见,而在黑种人、日本人和中国人中却很少发现这种缺失突变型[11]。其突变包括CCR5Δ32/CCR5Δ32纯合子型和CCR5/CCR5Δ32杂合子型,其中纯合子只占小部分,绝大部分是杂合子型。纯合子基因型对HIV感染有高度抵抗性,但也并非是绝对的;而杂合子基因型人群感染率也比一般人群低35%,其AIDS发病也较缓慢,一般可延长2~4年。并且CCR5突变缺失型拥有正常免疫功能和炎性反应,因此,关于CCR5位点的拮抗剂成为目前HIV药物研发的热点。
2.2CCR5拮抗剂 传统的抗HIV-1药物主要为反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂,主要通过和底物竞争结合酶或者与酶分子结合使其变性,进而破坏HIV-1的生活周期,从而达到抑制病毒复制的作用。这种药物虽然在一定程度上推迟了病情的恶化,但同时也产生一些问题,如长期用药导致病毒耐药性的产生、昂贵的药物价格、药物的不良反应等。因此,迫切需要研发新的、与以往药理机制不同的抗HIV-1药物[2]。目前,关于CCR5拮抗剂的药物研究成为研究者们关注的热点。总的来说,以CCR5为靶点的HIV-1受体拮抗剂主要包括以下几大类:趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体及肽类化合物等。
2.2.1CC类趋化因子 CC类趋化因子(如RANTES、MIP-α和MIP-β)作为CCR5的天然配体是HIV-1受体的天然拮抗剂,其作用机制主要是诱导CCR5内吞作用。虽然低水平CC趋化因子在一定程度上可以保护细胞抵抗HIV-1感染,但由于天然趋化因子半衰期短,同时能诱导炎性反应等缺陷而不适合临床应用[14]。与之相比,趋化因子衍生物不激活信号通路,通过诱导CCR5内吞而减少HIV-1与受体结合,因此更具优越性,其中主要以AOP-RANTER、重组人趋化因子CCL14(HCC-1)和vMIP-Ⅱ等为代表。AOP-RANTER是将AOP基团耦联到RANTES氨基末端而产生的强CCR5拮抗剂。它可诱导细胞膜表面的CCR5不可逆的被内吞,减少R5型HIV-1 gp120与CCR5结合,从而抑制病毒感染,并且AOP-RANTES不会产生趋化作用而引起相关不良反应。HCC-1的蛋白水解产物通过促进细胞Ca2+释放和CCR5内吞作用,能使细胞膜上的CCR5表达量减少75%,具有较强的CCR5拮抗作用。vMIP-Ⅱ是由人单纯疱疹病毒8编码的趋化因子,能与大量CC类和CXC类细胞因子受体高亲和力结合,能同时抑制由CCR5和CXCR4介导的HIV-1入侵,此类大分子拮抗剂主要由于生产成本高、口服利用度差等缺点而限制了其发展。
2.2.2非肽类小分子化合物 非肽类小分子化合物主要通过与跨膜区的关键氨基酸残基组成的袋状结构结合,进而诱导ECL2发生构象改变,使HIV-1 gp120无法与CCR5结合,从而阻断了HIV-1侵袭细胞[15-16]。目前,研究的小分子化合物主要包括吡咯烷类化合物、托品烷类化合物、哌啶类化合物、螺环二酮哌嗪类化合物等。TAK-220是吡咯烷类化合物,其作用于CCR5跨膜α螺旋4、5、6,选择性抑制RANTES和MIP-α与CCR5结合,不抑制MIP-β与CCR5作用,其口服生物利用度较好,与其他抗HIV-1药物一起使用具有协同作用,具有较强的抗高耐药性活性。SCH-C是小分子肟哌啶类化合物,也是第一个进入临床使用的小分子CCR5拮抗剂,它与CCR5的1、2、3、7跨膜区结合,从而改变CCR5胞外区的构象,可以有效地抑制R5型病毒株在细胞内复制。对这类小分子化合物增加或修饰某些基团能明显增强其抑制病毒作用和药物吸收率。由于小分子化合物的生产成本较小分子蛋白少,能有效抑制HIV-1感染,同时不引起炎性反应等优点,目前这类药物在CCR5拮抗剂研究中占主导地位,但小分子化合物不能下调细胞表面CCR5的表达,口服或注射药物后易出现头晕、呕吐等不良反应[17],同时其药效作用也受细胞类型和细胞表面CCR5水平的影响。
2.2.3单克隆抗体 CCR5的胞外结构包括N-末端和ECL1-3,理论上可以为单克隆抗体提供多个抗原表位识别位点,但目前报道有效的单克隆抗体并不多,仅有PRO140、mAb004等几种[18]。根据识别位点的不同,可将单克隆抗体分为以下3类:第1类,识别CCR5的N-末端;第2类,识别ECL2;第3类,识别CCR5多个胞外位点。其中,第二类单克隆抗体抑制病毒感染细胞的功效最强。虽然单克隆抗体具有高度靶向专一性、半衰期较长等优点,但由于它容易诱发机体产生中和抗抗体、引起过敏反应、不能下调细胞表面CCR5表达等缺陷,因此极大地限制了其发展。
2.2.4CCR5肽类拮抗剂 CCR5肽类拮抗剂与单克隆抗体相似,主要通过与CCR5胞外结构域结合而产生抑制病毒感染作用,但它不同于小分子拮抗剂产生的毒性作用,安全性较好。目前主要通过噬菌体肽库筛选技术筛选出与靶蛋白特异性结合且具有高度亲和力的多肽[19]。其具有制备成本低,制备的多肽活性高、组织穿透性较好、不易诱发机体免疫反应等优点。但由于多肽本身在体内不稳定,容易被机体消化降解。
2.3sCCR5拮抗HIV-1感染的推测 尽管上述4种CCR5拮抗剂都可有效抑制HIV-1感染,遏制AIDS的流行,但各自都有其缺陷,且由于其作用机制和作用位点较为单一,因此容易导致耐药性产生。近年来,研究者在人血清中检测到一种sCCR5蛋白分子的存在,其相对分子质量约为22.0×103,大概是膜表面CCR5蛋白相对分子质量的一半。针对膜受体特征性结构的一系列单克隆抗体检测发现,sCCR5蛋白包含N-末端、ECL1、ECL2及ECL2近C-末端尾部等结构,且在血清中的浓度与血清中CCR5配体MIP-β浓度呈正相关[20]。通过提取PBMCs的RNA进行RT-PCR检测和核酸测序分析发现产物为单一的cDNA,且核苷酸序列与之前公布的CRR5 cDNA序列完全一致,因此推测出机体内并不存在表达sCCR5的单独DNA,sCCR5同样来源于体内CCR5的编码序列,可能是膜CCR5在第5跨膜区的裂解产物[20]。DOI等[21]通过对合成的ECL2近C-末端的一段多肽检测,发现其在有无CD4分子的情况下均能抑制R5和X4 HIV-1感染。与作用于单一位点的CCR5拮抗剂相比,sCCR5具有多个抗HIV-1感染结构(N-末端、ECL2及ECL2近C-末端尾部结构),由于sCCR5是天然存在于人血清中的蛋白质分子,因此具有半衰期较长、毒性作用小、不易诱发机体不良反应及中和抗体等优点。
sCCR5潜在的功能目前尚不明确,推测sCCR5可通过以下几个方面拮抗HIV-1感染:其一,sCCR5可通过与膜表面CCR5分子竞争HIV-1 gp120来抑制HIV-1感染作用。由于sCCR5包含N-末端、ECL2及ECL2近C-末端尾部结构,因此具有与gp120结合的多个位点,可在gp120与CCR5作用的多个步骤中与gp120结合,引起其构象发生改变,阻断病毒包膜与细胞膜发生融合,使病毒的核酸物质无法进入细胞。其二,sCCR5可通过阻断膜表面CD4分子来抑制HIV-1感染机体细胞。KIM等[22]发现,无论gp120存在与否,裂解的膜表面CCR5均可与CD4分子形成复合物,且这种sCCR5和CD4在水平极低的情况下,复合物依然可形成。其三,sCCR5可间接通过CC类趋化因子来抑制HIV-1感染。由于血清中sCCR5与CC趋化因子存在正相关关系,推测二者可能存在促进对方表达分泌机制。如前所述,CC类趋化因子具有抑制HIV-1感染效应,其作用机制主要包括2个方面:一方面,CC趋化因子作为CCR5的天然配体,可以与gp120竞争膜表面CCR5分子;另一方面,趋化因子还具有诱导CCR5内吞作用,通过减少细胞膜上CCR5的数量从而达到抑制HIV-1感染作用。
综上所述,sCCR5由于具有多个gp120结合位点及多条途径拮抗HIV感染,且作为天然存在于人血清中的蛋白分子,具备安全性好、半衰期较长、不易诱发中和抗体及不良反应等特点,因此是一种新颖的、理想的HIV-1拮抗剂。针对目前HIV-1流行的严重性和致命性,可用药物的单一性及耐药现象的普遍性等现状,研制sCCR5并明确其作用机制对于HIV-1的预防和治疗具有重要意义。