荆 锋,宋志红
陕西省渭南市大荔县医院:1.眼科;2.外三科,陕西渭南 715103
葡萄膜炎是临床中常见的致盲性眼科疾病,主要累及葡萄膜、视网膜、视网膜血管与玻璃体。该病好发于青壮年,病情较长,且存在反复发作等特点,治疗难度较大[1]。有研究指出,葡萄膜炎在我国致盲性眼病中排4~7位[2]。有研究指出,我国葡萄膜炎疾病中以Behcet病与Vogt-小柳原田综合征(VKH))为主[3]。目前,多数研究认为葡萄膜炎是一种炎症性疾病与免疫性疾病,但具体病因至今仍不明确,但大多数学者认为感染与免疫反应参与葡萄膜炎的发生[4-5]。随着医学技术的不断发展,作为固有免疫系统的重要组成部分,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体被认为参与了多种疾病的发生与预后,其在眼科疾病中的作用亦被多数学者认可,但其在葡萄膜炎中的的作用临床中研究较少。故笔者结合自身临床实践选取290例葡萄膜炎患者作为研究对象,旨在研究NLRP3在葡萄膜炎发生及预后中的作用,旨在为临床中该病患者诊断治疗提供帮助,现报道如下。
1.1一般资料 选取2019年4月至2020年2月本院收治的葡萄膜炎患者290例作为观察组,另选取同期在本院体检健康者280例作为对照组。观察组男155例,女135例,年龄26~42岁,平均(32.33±4.68)岁,均为中间型葡萄膜炎患者;对照组男143例,女137例,年龄25~43岁,平均(32.87±4.73)岁。2组性别、年龄等一般资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究获得本院伦理委员会批准通过。
1.2纳入及排除标准 纳入标准:(1)本研究获得患者或其家属同意,并签署知情同意书;(2)玻璃体炎性细胞多于前房炎性细胞、玻璃体内典型雪球状混浊、特征性雪堤样病变、伴有后囊下白内障、黄斑囊样水肿、视盘炎、视网膜周边血管炎等患者。排除标准:(1)有其他眼科疾病如青光眼、结膜炎等患者;(2)患有严重的免疫疾病者;(3)患有精神抑郁类疾病或是长期服用相关药物者;(4)患者存在眼部疾病史或手术史者。
1.3方法
1.3.1试剂与仪器 4 ℃低温高速离心机购自长沙东旺实验仪器有限公司,荧光定量PCR仪购自西安天隆科技有限公司,酶标仪购自上海赛默科技生物发展有限公司,淋巴细胞分离液购自北京百奥莱博科技有限公司,酶联免疫吸附试剂盒购自南京信帆生物技术有限公司,RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒均为天根生化科技(北京)有限公司生产。
1.3.2标本采集 抽取受试者清晨空腹静脉血6 mL共分为2份,1份至于室温下凝血后采用3 000 r/min离心10 min得到血清;另1份用肝素抗凝后,加入淋巴细胞分离液后离心,抽取悬浮于中层的单个核细胞备用。取血清标本按照酶联免疫吸附试剂盒说明书中步骤,配置蛋白浓度梯度标准品、适当稀释血清标本,随后进行点样抗体孵育、洗板等操作,最后在酶标仪上读取450 nm处的吸光值(A450),对白细胞介素(IL)-1β表达水平进行记录观察。取外周血单个核细胞,采用RNA抽提试剂盒提取细胞中的RNA,随后紫外分光光度计测定浓度后取2 μg RNA进行反转录,得到cDNA样本后即逆行PCR扩增,NLRP3引物序列参考文献[6],经溶解曲线验证后用于实验。
1.4观察指标 检测2组受试者NLRP3表达与IL-1β水平,随后根据文献[6]标准对患者疾病严重程度进行评分,结膜睫状充血记1分,房水细胞或房水闪辉阳性记1分,角膜后沉着物记1分,虹膜粘连记1分,伴玻璃体细胞、黄斑囊样水肿、并发白内障或继发性青光眼等并发症的其中任何一项记1分,计算患者总得分,并分析评分与NLRP3、IL-1β的相关性。对观察组患者随访3个月,根据其治疗效果分为预后良好组、预后较差组。疗效判定根据本院自制的标准进行,预后良好组:患者临床症状表现消失,视力提高1~3行,3个月内无复发;预后较差组:患者临床症状无明显改善,视力无明显提高或下降,眼底荧光血管造影视网膜血管渗漏有所减轻,但改善程度较小。分析2组患者NLRP3、IL-1β表达情况,采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析NLRP3与IL-1β对预后良好患者的预测价值。
2.12组NLRP3相对表达水平与IL-1β水平比较 观察组NLRP3相对表达水平[(245.43±30.58)]、IL-1β水平[(78.73±9.08)ng/L]均高于对照组[(105.33±14.85)、(13.84±2.03)ng/L],差异均有统计学意义(t=69.187,P<0.001;t=116.794,P<0.001)。见图1。
2.2观察组患者疾病严重程度与NLRP3、IL-1β的相关性 290例患者疾病严重程度评分为(4.61±1.27)分,采用Pearson相关分析显示,疾病严重程度评分与NLRP3、IL-1β均呈正相关。见图2、3。
图1 观察组与对照组NLRP3相对表达水平及IL-1β水平柱状图
图2 疾病严重程度评分与NLRP3的相关性
图3 疾病严重程度评分与IL-1β的相关性
2.3随访3个月预后良好组与预后较差组患者NLRP3相对表达水平及IL-1β水平比较 随访3个月预后良好组患者188例,预后较差组患者102例,预后良好组患者NLRP3相对表达水平[(155.32±25.38)]、IL-1β水平[(43.28±7.65)ng/L]均低于预后较差组[(193.27±28.82)、(58.39±8.66)ng/L],差异均有统计学意义(t=9.561,P<0.001;t=12.653,P<0.001)。见图4。
图4 预后良好组与预后较差组NLRP3相对表达水平及IL-1β水平柱状图
2.4NLRP3、IL-1β对预后良好患者疗效的预测价值 采用ROC曲线分析NLRP3、IL-1β对预后良好患者疗效的预测价值,结果显示,NLRP3、IL-1β预测预后良好组患者的AUC为0.884(95%CI:0.835~0.934)、0.880(95%CI:0.832~0.928),最佳临界值为178.52、51.17 ng/L,灵敏度为88.6%、84.1%,特异度为78.4%、82.4%。见表1、图5。
表1 NLRP3、IL-1β对预后良好患者疗效的预测价值
图5 NLRP3、IL-1β对预测预后良好组患者疗效的ROC曲线图
葡萄膜炎的发病机制至今未得到证实,但多数学者认为与自身免疫功能紊乱有较强的关系,且动物实验也证明,免疫应答、花生四烯酸、前列腺素、白三烯等炎症因子的释放会导致葡萄膜炎的发生[7-8]。随着临床研究的不断深入,NLRP3炎症小体进入学者视线,有较多研究指出,NLRP3参与多类眼部疾病的发生及疾病进展[9-11]。另有研究指出,NLRP3炎症小体可活化IL-1β等细胞因子前体,使其成熟并释放[12-13],而IL-1β在葡萄膜炎中的作用亦十分重要,葡萄膜炎患者IL-1β水平会随着疾病的进展应激性增高[14]。
本研究显示,观察组患者NLRP3相对表达水平与IL-1β水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),表明葡萄膜炎患者发病后NLRP3与IL-1β水平均会出现应激性升高。有研究指出,葡萄膜炎患者NLRP3与IL-1β水平可出现显著升高,这主要是因NLRP3激活Toll样受体3/4通道,引起人体炎性反应,随着疾病的进一步发展,活性氧簇被激活,导致IL-1β细胞因子前体被活化并大量释放,最终引起NLRP3与IL-1β表达水平提升[15-16]。此外,活性氧簇可通过硫氧蛋白相互作用蛋白激活NLRP3炎症小体,即当活性氧簇水平升高时,掌握人体氧化能力的氧化还原酶硫氧还蛋白自生发生解离,而作为上配体的NLRP3因此得到激活,刺激其下游炎症小体IL-1β水平提升,从而导致葡萄膜炎的发生与疾病进展[17]。
本研究对患者疾病严重程度评分与NLRP3、IL-1β相关性分析显示,疾病严重程度评分与NLRP3、IL-1β均呈正相关,表明NLRP3与IL-1β参与患者疾病进程。本研究对患者随访3个月发现,预后良好组患者NLRP3与IL-1β水平均低于预后较差组。ROC曲线分析显示,NLRP3、IL-1β预测预后良好组患者的AUC分别为0.884(95%CI:0.835~0.934)、0.880(95%CI:0.832~0.928),NLRP3与IL-1β对患者的预后具有较高的预测价值,说明NLRP3与IL-1β参与了患者疾病预后进程。NLRP3胞内某些模式识别受体能够感受到细胞外的危险信号,这有助于炎症因子的成熟,从而参与人体免疫反应。NLRP3是目前研究较多的炎症小体,其功能异常与许多先天、后天免疫性疾病有关。本研究结果显示,NLRP3与IL-1β参与葡萄膜炎患者的疾病进程及预后,且二者与疾病严重程度也具有关系,可能是NLRP3与IL-1β之间相互影响所致。NLRP3可识别各种外源性、内源性炎症信号,通过不同的识别受体,促进炎症因子的生成,并产生炎症免疫反应;IL-1β是白细胞介素家族中的重要组成因子,主要由单核巨噬细胞合成与分泌,当NLRP3被活化后,将前体形式的IL-1β剪切成为成熟具有活性的炎症因子,从而参与到人体疾病的进展与发展中[18]。
综上所述,NLRP3作为固有免疫系统的重要组成部分,其参与了葡萄膜炎疾病的发生、发展及预后进程。NLRP3被活化后可激活下游IL-1β炎症因子的分泌,共同参与葡萄膜炎疾病发展。但NLRP3在葡萄膜炎患者中的具体作用机制仍需进一步明确,以期为临床中葡萄膜炎患者的治疗提供全新靶点。