红树莓提取物通过TGF-β1/Smad信号通路改善大鼠酒精性肝纤维化

李彤 李红灵 胡浩 谢晓君 叶莉娜 兰梅

(1.贵州省人民医院内镜中心，贵州 贵阳 550002；2.首钢水钢总医院消化内科，贵州 六盘水 553000)

肝脏纤维化是肝脏内一系列纤维组织增生的病理反应，引起肝纤维化的原因多种多样，当前影响最大最普遍的因素是酒精，如果不立即实施相关方案来预防和治疗肝纤维化疾病，肝组织的结构和功能会被严重破坏，导致肝硬化，对人类造成巨大的生命威胁[1]。由酒精因素引起的肝硬化称之为酒精性肝病(ALD)，即长时间饮过量的酒会导致肝脏组织损伤，发生一系列炎症反应。胡睿报道[2]目前可以通过抑制肝脏中星状细胞活化和弱化肝脏细胞外基质的沉积来达到控制酒精性肝病的目的。而这两者可以通过中草药及其提取物调控酒精性肝病的相关通路来实现。有研究[3]报道与酒精性肝纤维化疾病联系最为紧密的通路是TGF-β1-Smad 通路。吴建良[4]研究发现冬虫夏草及其提取物可以改善酒精性大鼠的肝纤维化疾病，其机制是冬虫夏草及其提取物中的多酚类物质下调TGF-β1/Smad 信号转导通路。红树莓为蔷薇科浆果，因其富含各种基本营养成分和有药理功能的活性化合物，在世界上享有“黄金水果”的声誉[5]。研究[6]表明红树莓提取物中富集大量的多酚类抗氧化物质，并且与冬虫夏草有着同样的功能，即对于肝纤维化具有保护作用。然而，到目前为止，对于红树莓提取物是否能缓解肝纤维化损伤的机制研究尚未见报道。因此，本实验通过构建酒精性肝纤维大鼠模型，用红树莓提取物来治疗酒精性肝纤维大鼠，观察大鼠肝脏组织的病理变化、血清生化指标及TGF-β1/Smads信号通路相关分子的蛋白表达变化，以期首次揭示红树莓提取物缓解酒精性肝纤维化损伤的作用机制，为后续天然药物抗肝纤维化理论基础。

1 材料与方法

1.1试验动物 健康且为SPF级的SD雄性大鼠60只，体质量180～220 g，由贵州医科大学动物中心提供。

1.2试验药物、试剂与仪器 试验药物：红树莓提取物由本试验制备；安珐特购自黑龙江江世药业有限公司。试验试剂：谷丙氨酸氨基转移酶(ALT)测试盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测试盒和总胆固醇(TC)测试盒购自南京建成科技有限公司；Masson三色染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；RIPA裂解液购自上海贝博生物科技有限公司蛋白26616 Marker(Thermo Fisher，美国)；PVDF膜(Merck Millipore，德国)；蛋白抗体TGF-β1和Smad7购自美国Proteintech有限公司。试验仪器：Leica RM2016 轮转式切片机；OlympusBX5型光学显微镜；梅特勒台式pH；TS-1000水平摇床；高速台式离心机；YT-6生物组织烘烤机；EPS 300型电泳仪；微量移液器；UV-1800型紫外分光光度计等。

1.3方法

1.3.1建立酒精肝纤维化大鼠模型及分组给药 60只SD雄性大鼠适应性正常饲养1周后，随机分为6组，每组10只，分别为空白组、模型组、红树莓低浓度组、红树莓中浓度组、红树莓高浓度组和安珐特组。其中空白组：不作任何处理，正常环境下饲养的大鼠，在开始灌胃给药后，给大鼠灌服等量蒸馏水，1次/d，持续4周；模型组：每天对大鼠灌胃5%乙醇8 g/kg，连续灌胃12周，酒精性肝纤维化模构建成功后，给大鼠灌服等量蒸馏水，1次/d，持续4周；红树莓低、中、高浓度组是在造模成功后每天分别灌服0.05 g/kg、0.125 g/kg和0.259 g/kg的红树莓提取物，1次/d，持续给药4周；安珐特组在造模成功后每天灌服21.6 mg/kg的安珐特阳性药，持续给药4周。末次给药后处死所有大鼠并采集血液和肝脏组织用于后续分析检测。

1.3.2指标检测 肝脏组织病理学检测：待肝脏组织分离后，取一部分组织放入福尔马林溶液中进行固定备用，带到实验室之后参照胡睿[2]所述方法对肝脏组织进行HE染色和Masson 染色，观察大鼠肝脏组织纤维化的程度及变化。血清生化指标检测：血清分离之后严格按照试剂盒说明书来检测大鼠血清中ALT、AST、TC的活性。蛋白表达水平检测：用Western-blotting 法检测各组大鼠肝组织中TGF-β1和Smad7的蛋白表达水平，具体操作参照陈永欣等人所述方法进行[7]。

2 结 果

2.1红树莓提取物对酒精性肝纤维大鼠肝脏组织形态学的影响 HE染色结果显示，空白组肝组织结构清晰，肝细胞形态正常、大小均匀，可见细胞核，汇管区无纤维结缔组织增生及炎性细胞浸润；模型组中肝组织结构严重破坏，肝细胞出现变性坏死，可见脂肪变性，汇管区及中央静脉区纤维结缔组织增生及炎性细胞浸润；给药后，红树莓低、中、高浓度组和安珐特组中肝组织破坏程度降低，肝细胞变性程度减轻，汇管区纤维结缔组织增生及炎性细胞浸润减少，见图1。Masson染色结果显示，空白组中汇管区仅有少量胶原沉积；模型组中在汇管区、中央静脉区及肝细胞间均存在大量的胶原沉积；与模型组比较，红树莓低、中、高浓度组和安珐特组中胶原沉积显著减少，且红树莓浓度越高，胶原沉积越少，见图2。

2.2红树莓提取物对酒精性肝纤维大鼠血清中ALT 、AST和TC含量的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清中中ALT、AST和TC水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，红树莓低、中、高浓度组和安珐特组中ALT、AST和TC水平显著降低(P<0.05)，且具有红树莓浓度依赖性。见图3。

2.3红树莓提取物对酒精性肝纤维大鼠肝脏组织中TGF-β1和Smad7蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠肝组织中TGF-β1的蛋白水平显著升高(p<0.05)，Smad7蛋白水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，红树莓低、中、高浓度组和安珐特组中TGF-β1的蛋白水平显著降低(P<0.05)，Smad7蛋白水平显著升高(p<0.05)，且具有红树莓浓度依赖性。见图4。

3 讨 论

肝纤维化疾病是肝脏组织受损伤的慢性过程，其致病机理受到多种信号通路中细胞因子、抑制因子以及靶细胞的调控[8]。而酒精性肝纤维化疾病的致病机理是由于乙醇及其代谢产物乙醛对肝脏产生慢性并且持续性的损伤，导致肝脏纤维组织异常增生和肝脏细胞外基质大量沉积，有研究表明这个致病过程具有可逆的特征[9]。因此，治疗酒精性肝纤维化疾病具有重大而深远的意义。本实验中，我们通过构建酒精性肝纤维大鼠模型，用红树莓提取物来治疗酒精性肝纤维大鼠，结果观察到红树莓提取物能缓解大鼠肝脏组织的破坏程度、减少肝组织胶原沉积，提示红树莓提取物能有效的改善酒精性肝纤维化大鼠肝组织损伤。

赵杰等[10]研究发现人类长时间饮酒会导致机体内的促、抗氧化物的水平发生明显的变化，进而逐渐损伤肝脏细胞。当肝脏细胞受到损伤时，细胞间通透性会显著增加，细胞中大量的酶会从胞内穿梭到血液，使得血液中主要的酶ALT，AST和TC 水平快速增加，因此，血液中这三种酶浓度的多少可以反映出肝脏受到损伤的程度，通常也作为肝脏损伤的标志性指标[11]。在本研究中，我们发现红树莓提取物能降低酒精性肝纤维化大鼠血清中ALT、AST和TC的含量，且具有红树莓浓度依赖性。以上结果表明红树莓提取物对酒精诱导的肝细胞损伤具有显著的保护作用。TGF-β1，即转化生长因子β1，它是一种功能多样的细胞因子，曹力波等[12]研究表明TGF-β1与细胞外基质的沉积存在着紧密的联系。同时闫冰等[13]指出TGF-β1是肝脏受到损伤后最主要最关键的促肝纤维化因子。TGF-β1可以促进肝脏星状细胞活化和增殖[14]。徐旭东等[15]研究发现TGF-β1通过与受体结合参与所有肝纤维化病理过程的关键环节。谢雷[16]研究发现Smad信号蛋白是细胞内目前确定的唯一的TGF-β受体。根据报道[17]Smad信号蛋白共有8种，Smad1～ Smad8，根据其结构和功能不同可分为3种类型：特异型、共同型和抑制型，抑制型包括Smad6和Smad7。研究[18-19]表明抑制型蛋白Smad7在TGF-β1信号传导过程中参与负反馈调控，被公认为是TGF-β1信号转导的拮抗剂。其原因是Smad7和受体调节型蛋白R-samd的结构比较相似，能够更有效更快的与Ⅰ型受体结合，从而阻止受体对R-samd的憐酸化，最终阻断信号传导来进行调控[20]。在本研究中，酒精性肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1蛋白显著升高，Smad7蛋白显著降低。在进行红树莓提取物组和阳性药安珐特处理后，肝脏组织组中TGF-β1的蛋白水平显著降低，Smad7蛋白水平显著升高，且具有红树莓浓度依赖性。以上结果表明，红树莓提取物能够降低酒精性肝纤维大鼠肝脏中TGF-β1和Smad7的蛋白水平，从而改善肝纤维化疾病损伤。

红树莓提取物可以有效防治酒精性肝纤维化大鼠肝组织炎症、坏死、出血以及纤维化程，缓解肝脏损害。同时，红树莓提取物能够降低酒精性肝纤维化模型大鼠血清ALT、AST和TC的含量，进而有效改善肝脏的功能。红树莓提取物还可以降低肝组织中 TGF-β1和Smad7的蛋白表达，说明红树莓提取物改善酒精性肝纤维的作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad7信号通路密切相关。但明确红树莓提取物改善酒精性肝纤维化的具体机制有待进一步研究。

(本文图1～图4见封三)