miRNA对肝星状细胞的作用在肝纤维化病程中的影响

刘兴远 白彬

肝纤维化是在多种致病因素作用下引起的肝脏中细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的异常沉积所致的病理过程。而ECM主要由活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)转化而成的肌成纤维样细胞所分泌的。microRNA (miRNA)是长度约为22个核苷酸的单链非编码RNA，近些年发现多种miRNA参与了HSCs的活化、增殖以及凋亡，并在其中起到了重要的调控作用。因此研究miRNA在HSCs中的作用可以为寻找诊断和评估肝纤维化的指标，以及为研发治疗肝纤维化的的基因靶向治疗药物提供新的靶点和思路。

一、HSCs的概述

HSCs定位于Disse腔内，其胞体紧贴肝窦内皮细胞和肝细胞。HSCs胞质内有大量的富含维生素A以及甘油三酯等物质的脂滴是其具有特征性的形态学表现。HSCs具有视黄醇代谢，肝窦血流调节，EPO生成等生理功能，除此之外，作为肌成纤维样细胞的主要出处，它还在纤维化中起到重要作用[1]。

当受到各种损伤因素的刺激后，静止状态的HSCs被激活，进而分化为肌成纤维样细胞[2]。目前有文献报道称衰老的HSCs相对于增殖状态的HSCs的增殖能力和产生胶原蛋白的能力减弱。但是同时也有文献报道称由肥胖导致的肝纤维化中，HSCs的衰老和肝纤维化水平无关[3]在HSCs的衰老对于肝纤维化的影响现在还存在争议。

二、miRNA对HSCs的调控

(一)miRNA促进HSCs活化的调控

1.促进活化

TGF所介导转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在HSCs的活化过程中起到重要的作用，miRNA作为重要的调控因子作用于TGF-β信号通路。Xia Xie等[4]通过Gene Expression Omnibus(GEO)筛选出MicroRNA-503，并通过靶基因分析以及相关信号通路研究发现,MicroRNA-503可以通过SMAD7作用于HSCs。miR-503/SMAD7可以通过TGF-β/SMAD途径增强HSCs的活化以及纤维化。Xiutao Fu等[5]通 GEO筛选了正常人，轻度肝纤维化以及晚期纤维化肝脏样本之间差异性表达的miRNA为miR-20a-5p。之后他们在京都基因百科全书(https://www.kegg.jp/ KEGG)中发现12个目的基因在TGF-β通路中显著富集。miR-20a-5p在肝纤维化中的下调导致TGFβRII激活，进而TGF-β信号通路被激活，随后激活巨噬细胞和肝星状细胞产生细胞外基质。

2.抑制活化

PI3K/AKT/mTOR作为调节细胞周期的重要细胞内信号通路同细胞的休眠、增殖、癌变和寿命直接相关。Liang H等[6]利用基因芯片分析，观察到miR-141是在肝星状细胞激活过程中上调最多的miRNA之一。通过功能分析发现miR-141抑制了靶基因的表达，降低了肝星状细胞的活性，并且抑制了促纤维化标志物的表达水平。此外miR-141的下调可以影响AKT/mTOR通路的抑制剂-磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)从而抑制肝星状细胞的活化。

核激素受体家族中之一的氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)作为配体诱导核受体，调控多种代谢。Le Tao[7]通过检测慢性乙型肝炎肝硬化患者的肝脏组织发现，miR-942作为配体诱导受体之一，可以通过抑制过PPARs的基因表达，阻碍肝星状细胞活化的发生。

Notch信号通路在脊椎动物和非脊椎动物大量存在，在进化上高度保守，在相邻细胞之间发挥作用，进而调节细胞、组织、器官的分化和发育。Juanjuan Li等[8]建立CCl4诱导的小鼠肝纤维化为体内模型以及以转化生长因子β1(TGF-β1)处理的HSC细胞系LX-2和HSC-T6为体外模型，发现，miR-489-3p的过度表达可以降低JAG1(jagged canonical Notch ligand 1)的表达，同时肝纤维化标志物的表达降低，因此得出miR-489-3p的过表达可以通过JAG1/Notch3通路抑制肝星状细胞的活化。

(二)对HSCs增殖的影响

Wang Z等[9]体内外模型中发现，MiR-203a-p可以直接抑制P66Shc的翻译，P66Shc的表达下降可以进一步的抑制线粒体中ROS的生成和肝星状细胞的增殖。Yong-Zhen Wang等[10]报道了，TGF-β1通过下调miR-454的表达来促进HSC-T6的活化和增殖，从而进一步上调Wnt10a基因的表达。MiR-454可以通过抑制Wnt10a基因的表达来阻止这一过程，从而抑制肝纤维化。

(三)miRNA对HSCs凋亡的影响

肝纤维化的逆转主要基于HSCs的凋亡。肝细胞凋亡后，金属蛋白酶抑制剂的合成减少，从而逆转肝纤维化的过程[11]。因此寻找促进HSCs凋亡的miRNA是研发抗纤维化药物至关重要的研究。

Xinjie Hao等[12]报道，经过miR-21处理后的LX-2细胞的IL-6, TNF-a,以及TGF-b1水平升高，α-SMA，I型胶原蛋白的表达增高，Bax/B细胞淋巴瘤(Bcl)-2比率和程序性细胞死亡4(programed cell death 4,PDCD4)的表达水平降低。同时PTEN的mRNA和蛋白表达产物减少，PI3K/AKT被促进，这表明通过PTEN/PI3K/AKT通路，miR-21可能抑制肝星状细胞的增殖并抑制其凋亡。

Xuemin Niu等[13]分析了丙型肝炎病毒诱导的肝硬化患者血清的miRNA的微阵列数据发现了miR-1273g-3p是上调最显著。miR-1273g-3p的表达上调可使PTEN的翻译减少，Col1A1、α-SMA的表达增加，从而肝星状细胞的凋亡减少。

Caspase是可对天冬氨酸残基后的肽键进行特异性切割的蛋白质。这一过程可以诱导HSCs凋亡。Jiang Wang等[14]报道了Caspase-9和PARP通过miR-29b抑制PI3K/AKT通路，从而促进HSCs (LX-1, HSC-T6)的凋亡来预防肝纤维化。Yang Wang[15]报道了在非酒精性脂肪性肝病、活化的HSCs和甲硫氨酸胆碱缺乏饮食诱导的纤维化小鼠模型中miR-130a-3p低表达。实验诱导miR-130a-3p的表达增加，结果发现miR-130a-3p的过表达促进HSCs的凋亡。

三、基于miRNA靶向HSCs在肝纤维化中的临床价值

未经治疗的肝纤维化最终会导致肝硬化，并增加患HCC的风险[16]。在7 000人的队列中，晚期纤维化的发生率约为2.8%[17]。随着科学技术的发展，科学家们发现非编码RNA(non-coding RNA)更加丰富的功能。其中，miRNA因其在基因调控中的作用而成为药物开发的可能靶点。

目前基于miRNA的治疗主要包括两类。第一类是miRNA的抑制，类似于反义疗法。用合成的单链RNA作为目标miRNA的互补链，进而目标抑制内源性miRNA的作用。另一类是miRNA的代替疗法。用人工合成的miRNA的类似物来模拟内源性的miRNA,进而使目标基因降解或者抑制，从而发挥沉默作用[18]。

miRNA与mRNA的结合不是完全的互补配对，只是部分性的，因此miRNA可以与多种mRNA结合发挥作用[18]。Friedman等[19]基于生物信息学手段预测了，超过60%的人类蛋白编码基因可被miRNA所调控。因此无论是在寻找肝纤维化的早期具有特异性和敏感性的诊断指标上，还是研发的抗纤维化的药物上，miRNA都具有广阔的前景和价值。

(一)miRNA在诊断中的作用 在肝纤维化的过程中，肝纤维化的程度和进展是衡量诊治效果的重要指标。肝活检是诊断肝纤维化的金标准。然而肝病理学检查是一种价格相对高昂的，有多种潜在并发症的一种有创操作。肝活检同时也受到穿刺者的采样的误差以及病理医生的分期判断差异而对技术水平有较高的要求。目前已经开发了各种非侵入性诊断工具，其中一些已经进入临床实践，包括血清学评分工具，如肝纤维化指数评估(ELF)、天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酶(AST/ALT)比率、纤维化-4 (Fib-4)评分和AST与血小板比率指数(APRI)，以及一些影像学工具，如瞬时弹性成像(FibroScan)、剪切波弹性成像(SWE)和声辐射力脉冲(ARFI)等[20]。但是这些非侵入性的诊断方法由于其早期的敏感性和特异性较差，无法满足临床诊断的要求。因此，寻找一种无创且可靠的评估肝纤维化的方式是目前迫切需要的

血清中的miRNA因为其稳定性好，简单可重复性高，现在已经成为包括炎症、肿瘤在内的多种疾病的生物标志[21,22]。miRNA在血清中以RNA结合蛋白结合和脂蛋白复合物结合两种方式，形成囊泡，如外泌体。外泌体与其他细胞膜接触融合后将利用外泌体内的脂质双分子层膜来保持miRNA结构与功能的稳定性，并传递到靶细胞内完成细胞间的信息交换，从而发挥对HSCs活化、增殖的调节作用。

MicroRNA-122已被鉴定为各种肝损伤的标志物，包括肝炎病毒感染，酒精性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等。 来自肝细胞的细胞外miR-122可被传递至肝星状细胞HSCs，以调节其增殖和基因表达[23]。吕金明等[24]在对多例慢性乙肝，肝硬化以及早期肝癌患者的研究当中，发现血清miR122单项检测在肝硬化、肝癌早期诊断中有一定价值,血清miR122联合AFP,CEA的诊断效能高于单一指标检测。

周兴蓓[25]对比了经过肝穿刺的慢性乙型肝炎患者和正常人的血清中的miRNA，找出了miRNA-34a和miRNA-337，miRNA-34a和miRNA-26a两组miRNA可能作为区分正常人和肝硬化患者以及监测肝硬化进展的指标。其中第二组miRNA-337的表达降低与肝癌TNM分期以及淋巴结转移密切相关。

然而，这些差异性表达的miRNA谱通常只是考虑的是促使肝纤维化的单一病理因素。在不同患者群体中识别肝纤维化早期阶段的诊断价值仍有待证明。Joeri Lambrech等[26]找出了4个与HSCs相关的miRNA，Let-7f-5p和miRNA-378a-3p，miRNA-451a, miRNA-142-5p, 建立了miRFIB评分。miRFIB评分与PDGFRβ水平的结合可以显著提高在异质性肝纤维化患者中的诊断效能。

(二)基于miRNA的治疗 在肝纤维化的早期，可以通过适当的治疗，如服用抗病毒药物或显著的生活方式改变阻止肝纤维化这一过程[27]。尽管有大量文献报道了控制或者逆转纤维化的理论和方法，但这都是基于动物实验和体外研究。目前尚且没有一种被FDA所批准上市的抗晚期肝纤维化的药物。因此对于寻找能够抗纤维化乃至逆转肝硬化以及寻找早期发现和监测肝硬化的指标是刻不容缓的任务。

Wu[28]合成并组装pH敏感性纳米胶束(T-PBP)负载miRNA-29b和miRNA-122， T-PBP胶束以磁共振成像可见方式有效地将miRNA-29b和miRNA-122转运至小鼠HSCs，通过下调纤维化相关基因(包括I型胶原蛋白α)的表达，产生协同抗纤维化作用。Shanshan Zhu等[29]报道了MiR-29b的过度表达降低了虾青素(Astaxanthin AST)处理的LX-2细胞中Bcl-2的表达，沉默它具有相反的效果。这表明AST可能是通过调节MiR-29b，抑制Bcl-2表达水平和升高Bax和Caspase-3表达水平来促进肝星状细胞的凋亡。张利芬等[30]通过将miR-484的抑制剂转染至HSC-T6细胞，qPCR提示抑制剂组的Fis1和caspase-3mRNA的表达量提高，而且肝纤维化的标志物降低，这表明miR-484的靶基因为Fis1，肝纤维化的指标降低。此外抑制剂组的细胞48h后细胞凋亡明显高于空白组以及阴性组,这提示miR-484有促进HSCs凋亡的作用。

四、展望

miRNA作为一种重要的非编码RNA，可以在HSCs的活化，增殖以及凋亡多个方面进行正向或者负向的调控，影响基因的表达水平。但是我们应当同时看到，尽管miRNA在进化上高度保守，但是大量的文献报告的miRNA的表达差异谱也不尽相同，这可能是由于种属差异引起的，可能是各种导致肝纤维化的病因激活HSCs的方式不同所致。由于主要受到病理活检有创操作的限制，基于人类肝脏组织作为标本作为探寻差异性的文献报道较少。目前探寻差异性表达的miRNA主要是基于体外模型(如HSC-LX2和HSC-T6)，实验小鼠以及人类血清的外泌体。外泌体miRNA作为一种新型的信息分子，目前对于其在肝纤维化过程中的基础机制的研究仍然较少。这些都是应当作为肝病学者今后亟需不断探寻的问题和方向。