不同临床结果的乙型肝炎病毒感染者血清前基因组RNA检测的诊断价值

马海霞 赵丽萍 陈文洁 胡伟宏 张世坤

目前，全球仍然约有20亿人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中包括约2.57亿慢性乙型肝炎(CHB)患者[1]。目前认为肝组织中共价闭合的环状DNA(cccDNA)是反映HBV复制和感染状态形成的关键因素，完全消除HBV cccDNA是评估CHB患者治愈的金标准[2-4]。然而，肝内HBV cccDNA的检测依赖于肝活检，但因为其有创的操作阻碍了肝活检的广泛应用[5-6]。

HBV前基因组RNA(pgRNA)是HBV复制的中间产物，许多研究已证实，血清HBV pgRNA是由感染的肝细胞中的HBV cccDNA转录而来[7-9]。当病毒的逆转录和DNA合成受到抑制时，接受核苷类似物(NA)治疗的患者的血清HBV RNA水平可以反映cccDNA在肝细胞中的转录活性[10]。这些pgRNA以HBV RNA病毒样颗粒的形式存在于成熟病毒颗粒的核衣壳中，并与持续的病毒感染和病毒学反弹风险相关[11]。然而，对于经NA治疗后不同临床结局的患者，pgRNA作为cccDNA的替代是否有差别，目前尚无相关的分层分析。本研究收集了HBV感染后接受NA治疗的210例临床结果不同的患者的血清样本，分析pgRNA在不同患者中的有效性。

资料与方法

一、一般材料

从2016年至2018年，本研究共纳入在河南焦作煤业(集团)中央医院接受恩替卡韦(ETV)或替诺福韦(TDF)治疗超过6个月的210例不同临床结局的HBV感染者，包括无症状携带者(ASC)、慢性乙型肝炎(CHB)患者和肝硬化(LC)患者各70例。根据2015年《慢性乙型肝炎预防和治疗指南》[12]的诊断标准收集临床标本，将血清样品快速保存在-80 ℃直至进一步使用。其中ASC组的所有患者HBV DNA结果均为阳性，且根据Metavir评分系统，组织活性指数(HAI)或纤维化指数(F)均大于或等于2。另外选取对照组，包括健康人和其他病毒感染者，包括丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV)的患者。本研究得到河南焦作煤业(集团)中央医院伦理委员会的批准，每个登记的患者都签署了知情同意书。

二、研究方法

(一)血清pgRNA水平的检测 使用StepOne Plus荧光定量PCR(qPCR)机器(美国Life Technologies)检测HBV感染者的血清pgRNA水平，具体方法和所使用的特异性引物及TaqMan探针参照先前文章[14]。

(二)血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平的检测

根据说明书，使用病毒基因组DNA提取试剂盒(北京新诺)提取HBV DNA，然后在-80 ℃下保存直至使用。HBV DNA和高灵敏度HBV DNA的水平用市售的实时荧光定量试剂盒(湖南圣湘)进行定量检测，并使用试剂盒(美国Abbott)定量检测HBV血清标志物HBsAg和HBeAg的水平。

三、统计学分析

血清HBV DNA水平以及HBsAg和HBeAg的浓度进行对数转换后分析，数据统计和分析使用SPSS 23.0软件(IBM，美国)进行。采用Kolmogorov-Smirnov正态性检验：正态分布的数据表示为平均值和标准差，并使用T检验比较两组之间的差异，采用ANOVA检验比较多组的差异；非正态分布的数据表示为中位数和四分位区间(IQR)，使用Kruskal-Wallis检验比较多组间差异。采用Pearson相关分析分析各指标见的相关程度。双尾P<0.05认为差异具有统计学意义。

结 果

一、不同临床结局患者的血清标志物水平的比较

表1列出了各组患者的基本临床信息，结果显示入组人群中超过一半的为男性，LC组患者的年龄显著大于ASC和CHB组(P=0.003)。对于各标志物来说，ASC组和CHB组患者的各标志物水平也显著高于LC组(P值都小于0.001)，反映了肝硬化患者病毒的不活跃状态。

表1 HBV感染后不同临床结局患者的临床特征对比

二、不同临床结局的HBV感染患者不同血清学指标的相关性分析

所有入组患者的不同血清学指标之间的相关性如图1和图2所示，结果表明HBV pgRNA和HBV DNA、HBsAg水平之间都呈正相关关系(HBV pgRNA与HBV DNA：R=0.613，P<0.001 ; HBV pgRNA与HBsAg：R=0.503，P<0.001)。对不同临床结局的HBV感染患者血清学指标之间的相关性进行分层分析结果显示，三组患者的HBV pgRNA与HBV DNA水平都呈正相关(ASC组：R=0.584，P<0.001; CHB组：R=0.634，P<0.001; LC组：R=0.493，P<0.001)。然而，在ASC和CHB组中，HBV pgRNA和HBsAg水平之间呈正相关关系(ASC组：R=0.512，P<0.001；CHB组：R=0.537，P<0.001)，但LC组则没有正相关关系(R=0.065，P=0.582)。

图1 HBV pgRNA 和 HBV DNA的相关性分析

图2 HBV pgRNA 和 HBsAg的相关性分析

三、比较HBeAg阳性和阴性组中HBV pgRNA和HBV DNA的水平及其相关性

将210例HBV患者的标本分为HBeAg阳性组和HBeAg阴性组进行对比，如图3所示。结果表明，HBeAg阳性组的HBV pgRNA和HBV DNA水平都显著高于HBeAg阴性组的水平(P<0.001)。HBV pgRNA和HBV DNA水平在HBeAg阳性组和HBeAg阴性组患者中均呈正相关关系，但前者的相关性强于后者(HBeAg阳性组：R=0.587，P<0.001； HBeAg阴性组：R=0.313，P<0.001)。

图3 根据HBeAg状态不同分组HBV pgRNA和HBV DNA的对比

四、HBV DNA水平<500 IU/mL的标本中HBV pgRNA的检出率分析

将患者按照HBV DNA的水平进行划分，分析结果如表2所示。HBV DNA<500 IU/mL的血清标本中HBV pgRNA的检出率为72.8%。基于此结果，笔者从54名HBeAg阴性患者中选择了样本进行进一步分析，包括37例HBV DNA水平<20 IU/mL的标本和17例HBV DNA水平> 20 IU/mL但<500 IU/mL。统计分析表明，两组中HBV pgRNA的检出率分别为17.6%和41.2%。

表2 HBV DNA水平<500 IU/mL患者的临床特征

讨 论

据统计，全世界有20亿的CHB患者，这其中15%～40%的患者因为得不到早期诊治会发展为LC或HCC[13]。目前，依靠血清HBsAg、HBeAg、HBV DNA和ALT的水平，结合肝纤维化检查，可以区分不同时期的HBV感染，确定治疗时机，判断停药时间。然而，常用的标志物依然不能准确反映cccDNA的复制状态。

既往研究发现，CHB患者的血清HBsAg水平与肝细胞核中HBV cccDNA的转录状态密切相关，因此可以用血清HBsAg水平反映肝细胞核中HBV cccDNA的清除率[14]。本研究的结果显示，三组患者之间的HBV DNA和HBsAg水平显著不同，具体来说，CHB组的HBV DNA和HBsAg水平均高于LC组，表明LC患者HBV复制的不活跃。此外，CHB组和LC组患者的血清HBV pgRNA水平也与HBV DNA和HBsAg的水平一致，表明pgRNA与HBV DNA和HbsAg的一致性。血清HBsAg的消失是CHB“功能治愈”的标准，但由于HBV DNA在HBV感染的肝细胞中的整合，血清HBsAg有时会出现持续低表达，在这种情况下，血清HBsAg无法反映肝脏中cccDNA的活性[14-16]。与血清HBsAg不同的是，血清pgRNA的来源只有cccDNA，可以准确反映肝脏中cccDNA的状态。

有研究表明CHB患者血清中的HBV RNA和HBV DNA水平呈正相关[17]，本研究也发现血清HBV pgRNA水平和HBV DNA表达水平高度相关。然而，不同临床结局的HBV感染者，尤其是ASC组和CHB组中，血清HBV pgRNA、HBV DNA和HBsAg水平之间存在一定的相关性。这些结果表明，HBV感染者血清中HBV pgRNA与其他传统指标相当。但值得注意的是，尽管各种HBV血清学和分子标志物之间呈正相关关系，但相关程度并不高，这可能归是由于病毒变异的积累以及临床研究中宿主背景的多样性造成的。

目前，抗病毒疗效评估主要取决于HBV DNA水平，但HBV DNA低于检测极限时仅表示病毒的逆转录被抑制，并不能作为停药标准[18]。因此本研究分析了DNA水平<500 IU/mL的HBV感染者的HBV pgRNA水平，发现检出率高达78.9%，并且即使在HBV DNA水平低于20 IU/mL的情况下，也有17.57%的患者检测出HBV pgRNA。因此，仅通过检测HBV DNA拷贝数来评估抗病毒治疗的疗效具有一定的局限性，而与HBV DNA相比，血清HBV pgRNA在监测治疗期间持续病毒应答和cccDNA水平的变化方面具有优势。