长链非编码RNA HOX 转录反义RNA/miR-124参与乳腺癌细胞转移的调控研究

张辉

研究表明，长链非编码 RNA（LncRNA）能通过募集多梳蛋白复合物并使其定位到HOXD 基因位点，从而促进乳腺癌的发生与发展[1]。HOX 转录反义RNA（HOTAIR）是一种反式LncRNA，在乳腺癌组织中处于高表达状态，且与肿瘤细胞转移有关[2]。microRNA 是一类较短的非编码RNA分子，在直肠癌组织中，miR-124 可通过抑制信号传导抑制肿瘤的生长。研究表明，miR-124 在乳腺癌组织中表达水平较低，可能与患者病情进展有关[3]。本研究拟观察LncRNA HOTAIR/miR-124 参与乳腺癌细胞转移的调控情况，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018 年2 月至2020 年3 月浙江省温州市中医院收治的行乳腺癌切除术患者87 例，纳入标准：（1）既往无放、化疗史，无免疫及内分泌治疗史；（2）临床资料完整；（3）患者及家属对本次研究知情，并自愿签订知情同意书。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤或血液系统疾病者；（2）孕产妇；（3）HIV 阳性者；（4）精神疾病患者。收集患者肿瘤组织及癌旁组织，并经病理学检查确诊为乳腺癌。其中年龄33 ～73 岁，平均（52.3±12.7）岁；TNM 分期[4]为Ⅰ期36 例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期14 例，Ⅳ期9 例。

1.2 方法

1.2.1 细胞株与主要试剂 人正常乳腺上皮细胞 MCF-10A、乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231 及T-470（上海钰博生物科技有限公司）；Trizol 试剂（Thermo Fisher）；山羊抗小鼠IgG（qRTPCR）试剂盒（美国Ambion 公司）；miR-124 逆转录引物（上海海方生物技术有限公司）；细胞增殖测定试剂盒CCK8（吉满生物科技有限公司）；E-cadherin、Vmentin、Snail、Slug、Zebl、SP1、GAPDH-抗（美国Abcam公司）；Invasion和Migration试剂盒（美国Cell Biolabs）。

1.2.2 RT-qPCR测定 乳腺癌组织及癌旁组织按照试剂说明书提取组织总RNA 并溶于20 l DEPC 水中，－80℃冷藏备用。采用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，采用RT-qPCR 法测定HOTAIR和miR-124表达情况。HOTAIR表达水平测定：选择组织和血清中稳定表达的-actin 作为内参，HOTAIR 引物及-actin 由Primer5 软件进行设计，经BLAST 比对后进行合成。引物序列：actin 上游5’-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3’，下游5’- GCACGAAGGCTCATCATTCA- 3’；HOTAIR 上游5’-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3’，下 游 5’-ACAT-AAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3’。采用2－△△Ct法计算各组mRNA 的相对表达量。

1.2.3 细胞增殖、侵袭以及转移能力的测定 MDA-MB-231、T-47D 细胞分别转染miR-阴性对照（miR-NC）、miR-124模拟物。转染后的细胞采用CCK8 试剂盒于24、48、72 及96h，在450nm 波长处测定吸光度值。使用Invasion和Migration试剂盒测定转染后穿透膜的细胞数目。将MCF-7 细胞进行处理，分为稳定高表达HOTAIR 的MCF-7 细胞株（HOTAIR组）、感染对照空病毒的MCF-7 细胞株（感染组）和未处理MCF-7 细胞株（空白组）。Transwell 小室培养，弃上清，加入多聚甲醛固定细胞，以0.01%结晶紫进行细胞染色，在光学显微镜下计数穿膜细胞数，随机选择5个视野，计算平均值。

1.2.4 pMIR-SP1 的3’UTR荧光报告载体构建及荧光素酶活性检测 构建pMIR-SP1 的3’UTR 载体。转染后分为4 组：miR-NC 和pMIR-SP1 的3’UTR组，miR-124 模拟物和pMIRSP1 的3’UTR 转染组，miR-NC 和突变型pMIRSP1 的3’UTR 组，miR-124 和突变型pMIR-SP1 的3’UTR组。再与质粒pRLTK共转染HEK293 细胞，24 h后使用双荧光素酶报告基因检测系统处理裂解细胞，检测荧光强度。

1.2.5 Western blot 法 裂解转染后的MDA-MB-231、T-47D细胞，以12000r/min离心10min，收集上清。miR-124：分别采用SP1 的一抗，GAPDH 的一抗孵育过夜后，加入山羊抗小鼠IgGHRP标记抗体孵育45min。HOTAIR：分别孵育E-cadherin、Vmentin、Snail、Slug、Zebl和GAPDH一抗及二抗。PBS 洗涤后，ECL 显色。

1.3 统计方法 数据采用SPSS22.0 软件分析，计量资料采用均数±标准差表示，采用 检验；采用GraphPad Prism 5.0软件进行图像绘制。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOTAIR 在乳腺癌组织中的表达各期乳腺癌组织中HOTAIR 表达均高于癌旁组织（均＜0.05）。见表1。

表1 HOTAIR 在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 MCF-7 细胞系侵袭比较 HOTAIR 组穿膜细胞数（123±8）个/视野，显著高于感染组（33±9）个/视野，差异具有统计学意义（=69.71＜0.05）；空白组穿膜细胞数（32±6）个/视野，与感染组差异无统计学意义（=0.86＞0.05）。

2.3 MCF-7 细胞发生上皮-间质细胞转化情况 HOTAIR 组E-cadherin 蛋白表达显著下降，Vimentin 蛋白和Slug 表达显著增加，Snail和Zebl表达水平无明显变化。见图1。

2.4 miR-124 在乳腺癌细胞系中的表达水平 miR-124 在乳腺癌细胞系MCF-7（2.1±0.18）、MDA-MB-231（1.0±0.08）及T-470（1.1±0.1）中的表达水平显著低于人正常乳腺上皮细胞MCF-10A（3.2±0.25），差异均有统计学意义（≥6.51，均＜0.05）。

2.5 miR-124 过表达抑制乳腺癌细胞系的增殖、侵袭和转移 与转染miR-NC比较，转染 miR-124 模拟物在 MDAMB-231 和T-47D 中的表达水平显著提高（封三彩图3a、b）。与转染miR-NC 比较，转染miR-124模拟物能显著抑制乳腺癌细胞的增殖（封三彩图3c、d）、侵袭（封三彩图3e）及迁移能力（封三彩图3f）。

图3 a：MDA-MB-231 中表达水平；b：在T-47D 中表达水平；c：对MDA-MB-231 增殖抑制作用；d：对T-47D 增殖抑制作用；e：乳腺癌细胞侵袭能力；f：乳腺癌细胞迁移能力

2.6 miR-124 靶基因SPI鉴定及过表达后对SP1 表达的抑制 与转染miR-NC和pMIRSP1 的3’UTR 比较，转染miR-124 模拟物和pMIRSP1 的3’UTR的荧光强度显著降低；与转染miR-NC比较，转染miR-124 模拟物后SP1mRNA和SP1 蛋白质表达水平显著降低。

3 讨论

HOTAIR 是LncRNA 的重要成员之一，其可通过与相关复合体结合并使染色体封闭，造成基因沉默[4]。叶柳青等[5]研究表明，在乳腺癌转移性表征中，HOTAIR呈高表达状态，是其他表征的数百至数千倍，且高于其在乳腺癌原发灶的表达水平。此外，HOTAIR 还可以增强乳腺癌细胞的放疗抵抗，增加疾病的治疗难度[6]。Vimentin 蛋白是间质性肿瘤和上皮源性肿瘤的鉴别标志；Slug、Snail和Zebl是细胞发生EMT时的转录因子。本研究中，HOTAIR 在乳腺癌组织中的表达水平较高，且HOTAIR 组乳腺癌细胞穿膜细胞数量较多。说明HOTAIR 参与了乳腺癌的发展，并且可以提高肿瘤细胞的侵袭能力。HOTAIR 组E-cadherin蛋白表达下降，Vimentin 蛋白和Slug 表达增加。说明HOTAIR 可能通过调节Slug 促进乳腺癌细胞发生EMT，从而促进肿瘤细胞进行侵袭和转移。

Slug 基因是miR-124 基因靶点之一，并与miR-124 的表达水平呈负相关。本研究结果显示，miR-124在乳腺癌细胞中的表达水平低于人正常乳腺上皮细胞。说明乳腺癌的发展可能与miR-124低表达有关。转染miR-124 模拟物在MDA-MB-231 和T-47D中的表达水平提高，且转染miR-124 模拟物能抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。说明miR-124 过表达后可抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和远处转移。本次研究通过构建pMIR-SP1 的3’UTR 荧光报告载体，检测鉴定miR-124 靶基因SP1，转染miR-124 模拟物后显示SP1 mRNA 和SP1 蛋白质表达水平降低。说明miR-124过表达可抑制SP1，而miR-124 低表达可能是乳腺癌发展重要原因。

图1 高表达HOTAIR 可促进MCF-7 细胞发生上皮-间叶细胞转化

综上所述，HOTAIR 在乳腺癌组织中过表达，可诱导乳腺癌细胞发生EMT，从而促进肿瘤细胞侵袭及转移；miR-124在乳腺癌组织中过表达，可通过调控转录因子SP1 抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。