蚕豆VfGASA1基因的异源过表达延迟拟南芥开花

高营　林云　袁星星　薛晨晨　陈新　朱月林

摘要： GASA（Gibberellic acid-stimulated in Arabidopsis）蛋白是一类受赤霉素调控的小分子蛋白质，参与植物生长发育的多条途径。本研究在蚕豆（Vicia faba）中同源克隆了VfGASA1基因，该基因的开放阅读框全长为363 bp，编码1个包含120个氨基酸残基的蛋白质，VfGASA1在蚕豆叶片和嫩荚中高表达，亚细胞定位结果显示，VfGASA1是一个定位于质外体的分泌蛋白。异源过表达VfGASA1导致转基因拟南芥开花延迟、莲座叶数量增多，外施赤霉素能够恢复这一现象。实时荧光定量结果显示，转基因拟南芥植株中FT基因显著下调，而DELLA基因中的GAI基因显著上调，说明VfGASA1可能是通过间接抑制DELLA蛋白的表达从而调控植物开花。本研究结果为蚕豆的开花调控育种提供了理论依据。

关键词： 蚕豆;VfGASA1;拟南芥;开花时间;赤霉素

中图分类号： S643.6 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2021）01-0044-09

Heterologous overexpression of Vicia faba VfGASA1 gene delays flowering in transgenic Arabidopsis

GAO Ying1， 2， LIN Yun2， YUAN Xing-xing2， XUE Chen-chen2， CHEN Xin2， ZHU Yue-lin1

（1.College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;2.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： Gibberellic acid-stimulated in Arabidopsis （GASA） protein is a kind of protein with small molecular weight regulated by gibberellin and participates in various pathways of plant growth and development. In this study， the GASA gene VfGASA1 in faba bean （Vicia faba） was got by homologous cloning. The open reading frame（ORF） of VfGASA1 was 363 bp in length and encoded a protein containing 120 amino acid residues. VfGASA1 was highly expressed in the leaves and capsules of faba beans， and subcellular localization showed that VfGASA1 was a secretory protein located in the apoplast. Heterologous overexpression of VfGASA1 in Arabidopsis could delay flowering and increase the number of rosette leaves， while the phenomenon could be recovered by the application of exogenous gibberellin. Results of real-time PCR （RT-PCR） showed that the expressional level of ‘florigen gene （FT） was significantly down-regulated in transgenic Arabidopsis while GAI （one of DELLA genes） was significantly up-regulated. Therefore， VfGASA1 might regulate the flowering of plants by indirect inhibiting the expression of DELLA genes. This study provides theoretic basis for breeding programs targeted on the flowering control of faba bean.

Key words： Vicia faba;VfGASA1;Arabidopsis;flowering time;gibberellin

開花是指被子植物由营养生长向生殖生长的转变，是植物生命史的重要相变，也是农作物的重要农艺性状之一;开花时间受到不同信号的影响，在拟南芥中有光周期、自主途径、春化途径及赤霉素（GA）信号途径等[1-4]。一些关键的调控因子负责整合这些信号途径，包括FT、SOC1以及LFY的表达[5-7]，这些调控因子激活LFY、AP1和FUL在花序分生组织侧部的表达，诱导花原基的产生[8]。其中，FT是开花调控的整合因子和决定基因，各信号途径最终通过影响其表达水平而诱导开花。FT基因的表达量受到CO蛋白的正向调控[9]，CO蛋白在光照条件下积累，在黑暗条件下降解，引起FT的节律表达和蛋白质积累，从而影响开花[10]。

赤霉素是重要的植物激素之一，参与种子萌发、节间伸长、叶片发育、开花时间调控、花器官建成以及花粉成熟等生理过程[11-15]。DELLA蛋白是赤霉素信号途径中的核心抑制因子，能够结合众多下游蛋白质，阻碍GA信号的传递[16]。拟南芥共有5个DELLA基因（GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3），这些基因编码的蛋白质均可以抑制开花[17]。研究发现，DELLA蛋白可以结合CO蛋白，阻止CO蛋白对下游FT基因的调控，从而抑制植物开花[18];DELLA蛋白中的RGA蛋白可以结合FLC蛋白并促进FLC蛋白对SOC1和FT基因的抑制作用[19]。当植物感受到GA信号后，GA的受体蛋白GID1通过结构的改变与DELLA蛋白互作，使其泛素化并降解，受DELLA蛋白绑定的转录因子得以释放并行使功能，从而使得下游基因响应表达[20-21]。

植物体内有大量的基因受到GA的调控，但这些基因是如何行使功能的，目前尚不明确。GASA （Gibberellic acid-stimulated in Arabidopsis） 是一类受赤霉素调节的基因，最早在番茄GA合成缺陷突变体gib1中被鉴定[22]，目前已在多种单子叶植物（如水稻、玉米）[23-24]和双子叶植物（如拟南芥、草莓）[25-26]中被克隆。研究发现大多数GASA基因表达量都受到赤霉素的影响，这些基因可以调控植物生长发育，包括种子萌发、细胞伸长、细胞分裂、开花时间、胁迫响应和激素信号交流等[27-28]。GASA蛋白属于小分子多肽，一般长80～120个氨基酸，具有3个结构域：N端的信号肽、中间的亲水区域和C端高度保守的GASA结构域[29]。在模式植物拟南芥中共有15个GASA家族基因（AtGASA1～AtGASA15）[27-28]，其中AtGASA4、AtGASA6、AtGASA7、AtGASA8和AtGASA13受GA誘导表达量上调，而AtGASA1、AtGASA5、AtGASA9 和AtGASA11受GA诱导表达量下调[30]。AtGASA4能够促进拟南芥开花[31]，而AtGASA5却抑制拟南芥开花[32]，说明GASA基因家族在植物生长发育中出现了功能分化，但有关GASA蛋白的研究还不明确。

蚕豆是重要的冬季食用豆作物，在中国有广泛的种植[33]，在南方地区，蚕豆一般在冬季播种，次年春季收获鲜荚，促进蚕豆田间适量提早开花有助于蚕豆提前上市。前人研究发现，苗期春化处理可以导致蚕豆叶片中大量bHLH、ERF以及WRKY基因家族转录因子的基因表达量发生显著变化[34]，此外还有91个参与不同路径的蛋白质在春化处理后有显著积累[35]，但是关于进一步的机理研究以及其他途径对蚕豆开花时间影响的研究未见报道。由于蚕豆的基因组巨大，测序和组装的难度极大，其可用基因组信息较少[36]，因此有关蚕豆基因的克隆和功能研究较少。

本研究以通蚕鲜6号为研究材料，同源克隆VfGASA1基因，对VfGASA1蛋白的同源性和亚细胞定位进行研究，并在拟南芥中过表达VfGASA1基因，以期研究该基因对蚕豆开花及其他性状的影响，丰富蚕豆开花机制研究的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料及其 RNA 的提取

本试验采用的蚕豆（Vicia faba）品种为通蚕鲜6号，由江苏省农业科学院提供。按照根、茎、叶片、花、嫩荚、籽粒等组织取样后放入液氮中速冻，存于-80 ℃冰箱备用。用RNA提取试剂[天根生化科技（北京）有限公司]提取总RNA。

1.2 基因克隆

蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是豆科中与蚕豆亲缘关系较近的物种[37]，根据美国国家生物信息中心（NCBI）网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）提供的蒺藜苜蓿MtGASA13（LOC11422708）的序列信息，设计引物VfGASA-F1和VfGASA-R1（表1）进行PCR扩增，扩增程序：94 ℃预变性2 min;98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，终延伸5 min，循环数为33。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，并利用DNA回收试剂盒[擎科生物科技（南京）有限公司]纯化回收，测序获得VfGASA1序列。本研究所用引物根据需求按照序列信息设计，采用的软件为Primer 5。

1.3 同源比对

通过在线BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）序列比对，将同源性较高、不同植物品种的GASA家族基因进行系统进化分析，使用DNAMAN软件进行多序列分析，系统进化树用 MEGA 10.0 本地软件邻接法构建;利用InterPro网站（www.ebi.ac.uk/interpro）对蛋白质结构进行预测。

1.4 载体构建

根据pCAMBIA1305.1-GFP序列设计VfGASA1的接头引物VfGASA1-F2和VfGASA1-R2并扩增，Xba Ⅰ酶切产生的线性化载体和PCR产物通过重组酶（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行重组连接，构建

35S∶∶VfGASA1-GFP融合载体。利用DH5α大肠杆菌感受态转化连接产物，通过测序获得正确的单克隆菌株，菌株扩繁后利用质粒提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取质粒，并将其转入农杆菌感受态中。

1.5 亚细胞定位

将农杆菌在28 ℃ 条件下培养至OD600为0.5～0.8，收集菌体并用浸染液重悬至OD600为0.1左右，选择生长28 d左右健康本氏烟草（Nicotiana benthamiana）的倒三至倒五叶，利用注射器进行浸染，浸染后48 h内在激光共聚焦显微镜下观察荧光。观察到荧光后利用30%蔗糖水溶液处理叶片30 min，观察烟草叶肉细胞质壁分离后的荧光情况。

1.6 拟南芥浸染

向250 ml LB液体培养基中加入农杆菌菌液，28 ℃、220 r/min培养过夜。至菌液OD600达到1.0左右，室温离心收集菌体，配制植物浸染液，用等体积的浸染液重悬菌体。将长势良好的拟南芥花苞浸入农杆菌浸染液中，4 min后拿出并用保鲜膜包裹，避光倒伏放置24 h，然后按常规方法培育植株至结实，收获T0代种子。

1.7 RT-PCR分析

利用TaKaRa实时定量PCR试剂盒SYBR Green Ⅱ荧光染料法进行基因的表达量分析。设计特异性引物（表1），反应体系为：SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μl，Primer F/R 各0.8 μl，灭菌水6.4 μl，DNA模板2.0 μl，总体系为20.0 μl。进行Real Time PCR两步法扩增反应，每份样品设3个生物学重复。试验结果利用相对定量2-△△Ct方法计算表达量。

1.8 数据统计和分析

数据采用Excel软件绘图，用SPSS 23.0统计软件对平均数进行单因素方差分析（ANOVA）比较。

2 结果与分析

2.1 蚕豆GASA1基因的克隆与同源比对

根据与蚕豆亲缘关系较近的蒺藜苜蓿中的MtGASA13（基因识别号：LOC11422708）序列设计引物（表1），从蚕豆叶片cDNA中扩增出全长约 630 bp的单一条带，根据测序结果预测该基因编码序列（CDS）全长363 bp，编码1个包含120个氨基酸残基的蛋白质，将该基因命名为VfGASA1。进化树分析结果（图1A）显示，与VfGASA1同源性最高的蛋白质是来自苜蓿的MtGASA13（登录号：XP_003625068.1），相似性为88.3%，其次是鹰嘴豆CaGASA1蛋白（登录号：XP_004493436.1），相似性为85.8%，这也和豆科植物與苜蓿、鹰嘴豆有较近的亲缘关系一致[38]。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，与蚕豆VfGASA1蛋白同源性最高的蛋白质是AtGASA15（登录号：NP_001319515.1），相似性约为69.0%。根据InterPro网站（www.ebi.ac.uk/interpro）的预测，VfGASA1蛋白的一级结构包含3个结构域，前24个氨基酸残基是一段信号肽，第61至第120个氨基酸是GASA结构域，中间是一段不保守区域，与其他物种中同源蛋白相比，VfGASA1蛋白在GASA结构域内高度保守，包含12个半胱氨酸残基，而在信号肽区域的差异较大（图1B）。

2.2 VfGASA1亚细胞定位

根据TMHMM网站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）的预测，VfGASA1蛋白是一个分泌蛋白，可能定位于质外体，这与大部分GASA蛋白的定位有差别，为检测VfGASA1蛋白的亚细胞定位情况，将重组质粒35S∶∶VfGASA1-GFP以及PP2A-mCherry共同转入本氏烟草叶片中进行瞬时表达，结果发现绿色荧光蛋白（GFP）信号与膜marker的荧光重叠，均出现在细胞轮廓上（图2A），继续用30%蔗糖溶液对烟草叶片进行质壁分离处理，发现在质壁分离后的细胞膜和细胞壁上均能观察到GFP荧光（图2B），综合以上结果推测VfGASA1是一个定位在质外体的分泌蛋白。

2.3 VfGASA1基因的表达模式

GASA家族基因参与植物侧根、叶片、茎秆、花器官和种子的生长发育，因此VfGASA1的表达模式会决定其最终功能。我们通过RT-PCR对蚕豆不同部位VfGASA1的表达量进行测定，结果显示，VfGASA1在嫩荚中表达量最高，在叶中也有很高的表达量，在花器官中有一定的表达量，但是在茎和籽粒中表达量很低，而在根中几乎检测不到表达（图3），说明VfGASA1是一个在嫩荚和叶片中高表达的基因。

2.4 VfGASA1在拟南芥中抑制开花的机制

VfGASA1蛋白与拟南芥体内AtGASA15编码蛋白高度同源，此前未有关于AtGASA15功能的研究，为进一步研究VfGASA1在植物体内的作用，我们购买了拟南芥突变体gasa15，并在Col-0型（野生型）拟南芥中过表达了VfGASA1，在T2代筛选得到阳性转基因株系L16和L24。定量结果显示，在这2个阳性株系体内的VfGASA1有较高的表达量（图4A），过表达株系在长日照条件下（光照16 h/黑暗8 h），开花时间明显延迟（图4B、图4C），播种后第23 d，野生型以及gasa15突变体拟南芥均已开花，而L16、L24仍未抽薹（图4B），L16、L24株系在开花时莲座叶数量也较野生型及gasa15突变体拟南芥显著增加（图4D），说明外源VfGASA1基因的过表达可以延迟拟南芥的开花，gasa15突变体开花时间与野生型拟南芥比没有差异，这可能是由其他GASA基因的功能冗余导致的。

为明确VfGASA1是否参与开花信号途径，我们对长日照条件下拟南芥开花途径中的关键基因进行了连续定量检测，结果发现过表达植株AtFT的表达模式与野生型一致，但是转基因植株中AtFT的表达量显著降低，尤其在光照16 h后（图4E）。AtCO的表达模式及表达量在野生型与转基因拟南芥之间没有明显差异（图4F），此外，开花途径负调控基因FLC的相对表达量在L24植株中极显著上调，而正向调控基因SOC1的相对表达量显著下调（图4G），这些结果表明在过表达植株中开花途径被抑制。GA途径主要通过解除DELLA对CO的绑定，促进FT的表达从而诱导开花，因此我们对比了野生型和转基因株系DELLA基因的表达量，5个DELLA基因中，GAI在过表达株系L24中极显著上调（图4H）。

通过对开花基因以及GAI的定量分析，我们推测VfGASA1参与了赤霉素调控开花的过程，为验证这一猜想，我们对转基因拟南芥植株外施GA3处理，结果发现赤霉素处理后过表达VfGASA1株系L24与野生型的开花时间没有明显差异（图5），并且相对于未处理的植株，开花时间明显提前，外源赤霉素可以恢复VfGASA1对开花的延迟作用，说明VfGASA1缺失参与了赤霉素对开花时间的影响，并且起到负调控的作用，可能是通过促进DELLA基因中GAI基因的表达，从而抑制开花。

3 讨论

中国是世界第一大蚕豆消费国和生产国[39]，在蚕豆生产中晚花会导致蚕豆受到高温胁迫，从而使产量降低[40]以及异交率大幅提升[41]。近年来，蚕豆晚花给蚕豆的产量提升以及育种工作带来了极大的困扰，因此蚕豆晚花是亟待解决的问题。目前生产上常用苗期春化处理的方式促进蚕豆早花，但是这种方式需要大量前期投入，而且对某些春化不敏感品种没有效果，因此寻找其他办法，例如外源赤霉素处理等来促进早花对于蚕豆生产非常重要。

赤霉素信號途径通过解除DELLA蛋白对CO蛋白的抑制，提升CO蛋白对FT的转录激活能力，提高FT的表达，从而促进植物开花[18-19]。但是关于赤霉素下游基因如何行使功能的研究较少，GASA家族基因是一类赤霉素下游响应基因[27-28]，前人的研究发现部分GASA成员可以参与赤霉素对植物开花的调控，例如AtGASA4能够促进拟南芥提早开花[31]，AtGASA5能够抑制拟南芥开花[32]，此外GASA家族成员还能够调控株型建成以及种子大小等[27-28]，显示出该家族成员在分子育种中的潜力。

蚕豆庞大的基因组是蚕豆基因克隆和分子育种的巨大障碍[36]，前期关于蚕豆的研究较少，大部分集中于抗病和抗列当寄生基因的QTL定位[42]，以及产量相关性状的QTL定位[43]，关于蚕豆开花时间的研究仅有春化的相关报道[34-35]。本研究通过同源比对的方式从蚕豆cDNA中克隆出1个GASA家族基因并命名为VfGASA1，发现VfGASA1是一个定位在质外体的分泌蛋白，受到赤霉素的调控，在拟南芥中异源过表达VfGASA1能够显著延迟拟南芥的开花时间，荧光定量的结果显示在转基因植株中拟南芥DELLA基因中GAI基因的相对表达量显著上调，说明VfGASA1可能是通过影响DELLA基因的表达，从而参与赤霉素对开花时间的调节，考虑到VfGASA1定位在质外体，因此VfGASA1不会直接调控DELLA基因的表达，应该存在某种间接途径影响DELLA基因的表达，这需要后续的深入研究。

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（責任编辑：陈海霞）

收稿日期：2020-04-29

基金项目：国家食用豆产业技术体系生物防治与综合防控岗位科学家项目（CARS-08-G15）;江苏特粮特经产业技术体系集成创新中心项目[JATS（2019）399]

作者简介：高 营（1994-），女，河南南阳人，硕士研究生，从事豆类作物分子育种研究。（E-mail）3099618289@qq.com

通讯作者：朱月林，（E-mail）ylzhu@njau.edu.cn