基质硬度与肝癌细胞增殖及侵袭转移的关系

樊文哲，孙雪梅，吴德全

（哈尔滨医科大学附属第二医院 普通外科，黑龙江 哈尔滨 150086）

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌）是一种常见恶性肿瘤，因为肝癌细胞增殖能力强、侵袭转移发生早，多数患者确诊时已属于晚期并发生远处转移，即使能够手术者，其术后复发率也较高。所以，肝癌已成为仅次于肺癌的全球癌症相关死亡第二大原因[1]。肿瘤细胞侵袭转移是一个既涉及肿瘤细胞从原发灶向周边扩散，又涉及肿瘤细胞穿过血管内皮和趋化性通过邻近胞外基质的多环节多步骤的复杂过程。基质硬度是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的重要物理属性，大量基质蛋白沉积和交联可导致基质硬度增加。越来越多的研究表明，胞外固态基质不仅在肿瘤生长中起到结构支撑作用，更可作为肿瘤微环境的重要组成成分，参与癌细胞侵袭转移过程的调控。因此，基质硬度等物理信号的变化，对肿瘤细胞增殖和侵袭转移调控的研究逐渐受到重视。本文将分别从基质硬度如何通过参与细胞迁移运动、血管生成与血管表型、上皮间充质转化、干细胞性及糖代谢等途径影响肝癌细胞增殖及侵袭转移进行综述。

1 基质硬度与细胞迁移运动

细胞迁移是肿瘤细胞离开原发病灶向临近组织侵袭的起始步骤，肿瘤细胞在转移过程中有多种迁移方式，如间充质样迁移或阿米巴样迁移，但无论哪种迁移方式都依赖于肿瘤细胞和ECM之间的特殊理化作用。不同硬度基质上培养的细胞，形态特征和运动能力明显不同。细胞外基质硬度的改变可以破坏细胞间连接、影响水解酶的活性和黏附斑的形成，并改变整合素和细胞外基质成分之间的相互作用。普遍的观点认为硬度高的基质促进细胞迁移，即细胞迁移有趋硬性，这在多种类型的细胞中如成纤维细胞、白细胞、肿瘤细胞等均有证实[2-3]。所以，细胞外基质的硬度是影响细胞迁移的一个重要因素。

间充质样迁移需要激活整合素以利于黏附，并招募蛋白水解酶聚集，蛋白水解酶与ECM相互作用，促使基质纤维降解和重组，从而降低基质对细胞的阻力以利于细胞移动。阿米巴样迁移是一种非蛋白酶依赖的迁移方式，通过收缩挤压自身变形来促使细胞穿过胞外基质间隙。谭乔燕等[4]发现硬基质可通过促进应力纤维的发育、促进基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的分泌和整合素的表达等来促进细胞间充质样迁移。而软基质则可以通过增强细胞的柔韧性、形成环状排列的骨架纤维、减少MMPs的分泌和整合素的表达来诱导细胞阿米巴样的迁移。肿瘤细胞侵袭过程中，可以根据基质硬度的不同而随时变换迁移方式，以适应周围环境的变化，从而大大增强了肿瘤细胞的迁移能力。

侵袭性伪足的形成是维持肿瘤细胞高迁移和高侵袭能力的关键，也是促进肿瘤侵袭转移进程的重要分子事件之一。有报道显示，基质硬度的改变可影响肿瘤细胞侵袭性伪足形成及活性。Chakraborty等[5]发现，与正常肝细胞相比，肝癌细胞可过表达和分泌蛋白多糖Agrin，促进Arp2/3复合物依赖性侵袭性伪足形成。进一步研究显示，基质硬度增加促进Agrin表达，Agrin经整合素Lrp4/MuSK受体通路激活转录因子YAP，从而增强肝癌恶性表型[6]。由此可见，基质硬度可能通过影响Agrin-YAP途径调控肝癌细胞侵袭性伪足形成。另外，侵袭性伪足中信号蛋白Cas和FAK的磷酸化活跃，过表达Cas或FAK可增加硬基质表面生长的细胞侵袭性伪足的活性，说明基质硬度也可通过Cas/FAK信号通路调控侵袭性伪足的活性，进而促进细胞迁移。

2 基质硬度与血管生成及血管表型

血管生成是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发育形成新血管的过程。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是影响血管生成的关键因素之一。VEGF与血管内皮细胞受体结合后，受体发生自身磷酸化，触发酪氨酸激酶的系列信号级联反应，从而发挥生物学效应，诱导血管内皮细胞增殖和迁移，并最终分化为成熟血管。一般说来，肿瘤血管比正常组织的血管更畸形、更曲折、更易渗漏。肿瘤血管异常被认为是由于VEGF表达上调导致血管生长混乱和未能建立成熟的调节网络所致。Dong等[7]发现胞外基质硬度增加通过激活整合素β1-PI3K-AKT信号途径上调肝癌细胞VEGF表达，进而促进血管新生。ECM硬度也影响VEGF受体（VEGFR）的表达和血管发育。GATA2和VEGFR2 的表达随着底物硬度的增加而增加，其中GATA2 调节VEGFR2的表达[8]。VEGFR2 经过快速诱导和核移位，进行无需配体参与的磷酸化，引发MAPK、PI3K和AKT信号通路的激活，促进血管生成[9]。增加基质硬度还可以增强细胞与肿瘤微环境中可溶性因子间的反应，在某些情况下，基质硬度增加可以改变可溶性因子触发的信号通路[10]。基质硬度和可溶性因子之间的相互作用可能促进血管生成并诱导甚至恶化肿瘤样血管表型。

在血管生物学中，内皮细胞毛细血管样网络的形成受基质硬度的影响[11]。在血管生成过程中，MMP活化对ECM降解和基底膜重塑起重要作用，上调MMPs的活性，特别是膜型1 MMP（MT1-MMP）能够增加血管表型的改变和血管生成反应[12]。已有研究证实MT1-MMP的激活依赖于细胞的收缩和基质硬化[13]。另外，基质硬度增加可促进肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化，活化后的HSCs也可产生大量的血管生成因子，如VEGF和血管生成素1（Angpt1）或Angpt2，激活内皮细胞的受体并增强其功能，从而促进肿瘤血管生长[10，14]。

3 基质硬度与上皮间质转化（EMT）

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一种细胞分化过程，极化的上皮细胞历经变化之后，失去细胞极性和细胞间黏附，获得迁移能力、侵袭性和对凋亡的抵抗力，从而呈现间充质表型。持续恶化的EMT可能会导致各种病理情况的发生，如转移和组织纤维化。

EMT常发生于肿瘤侵袭转移的起始过程中，可溶性因子、ECM成分和缺氧可诱导肿瘤细胞从上皮状态向间质状态转化[15]。除此之外，基质硬化与可溶性因子协同作用也可以促进肿瘤细胞间充质转化，进而推动转移的进展。已有研究表明[10]，转化生长因子-β（transforming growth factors-β，TGF-β）诱导的EMT依赖于基质的机械特性，TGF-β可以在硬度较高的基质表面诱导EMT，但在硬度较低的基质表面则会诱导细胞凋亡。TGF-β1，被认为是上皮细胞（包括肝细胞）中主要的EMT启动子。胞外基质硬度增加可通过激活Smad2/3独立诱导肝癌细胞EMT发生，TGF-β1刺激使癌细胞EMT更为完全[7]。

NADPH氧化酶（NOX）是一种位于细胞膜上的酶，能产生与EMT相关的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[16]。研究显示，较高的基质硬度加强了伪足蛋白S100A11与NOX亚基p67phox和p47phox的相互作用，并促进了NOX的聚集。S100A11上调促进了ROS的产生和Snail的表达，这有助于EMT在HCC细胞中发生[17]。另一个伪足蛋白eIF4E也参与肝细胞癌基质硬度诱导的EMT，eIF4E在多种人类恶性肿瘤中高表达，并与癌症的发生和发展有关[18]。在较高硬度的基质刺激下，HCC细胞中Raf1和eIF4E的磷酸化水平以及Snail的表达显著增加。Raf1-elF4E通路调节Snail和MMP-3的表达，进而调控EMT发生[19]。另外，miRNAs的抑制或增强总是发生在EMT增加的肿瘤侵袭和转移中[20]。较高的基质硬度通过减少miRNA24-3p的表达，促进了TGF-β1的自分泌，并与Snail的高表达和肝癌细胞内EMT的发生有关[17]。

4 基质硬度与干细胞特性

癌细胞的干细胞特性主要表现为干性标志物表达、干性相关转录因子表达、化疗耐药及自我更新能力增强等，与癌细胞侵袭性增加和肿瘤患者临床预后不良有关。Schrader等[21]将Huh7 和HepG2细胞株培养在基质硬度为1 KPa和12 KPa的培养基上发现，与低硬度基质相比，生长于高硬度基质表面的肝癌细胞干性标志物的表达明显减少，但其对顺铂更耐受，说明高硬度基质可减弱肝癌细胞的干细胞性并增加其耐药性。而另外一项研究得出的结论有所不同，You等[22]将HuH7和Hep3B细胞株分别培养在底物硬度为6 KPa、10 KPa、16 KPa的培养基上，结果表明，不但肝癌细胞对奥沙利铂的耐药性随着基质硬度的增加而增加，并且CD133（+）/EpCAM（+）细胞比例、干性相关转录因子表达、自我更新能力也随着基质硬度的增加而增加。因此其认为，较高的基质硬度可诱导和增强肝癌细胞的化疗耐药性和干性特征。但Tian等[23]将MHCC97H细胞株分别培养在5.9 KPa、24.8 KPa及48.1 KPa的培养基上发现，细胞在软基质上呈现小而圆表型、干性标志物表达增加、细胞成球能力增强，表明生长在软基质上的肝癌细胞增强了干细胞特性。另外，生长在软基质上的肝癌细胞表现出对5-氟尿嘧啶更强的耐受性。显然，这一结果与以上的两个报道又不完全相同。由于目前基质硬度对肝癌干细胞性的研究报道较少，尚无法确认产生差异的具体原因，但我们分析认为出现上述差异的因素可能有以下几个方面：一是实验所选细胞株不同，可能每种细胞株对基质硬度的响应能力具有差异性。二是所选化疗药物不同，不同细胞可能对不同化疗药物的敏感性不同。总而言之，虽然现有的研究显示基质硬度对肿瘤干细胞特性诱导结果不完全一致，但是依然反映了基质硬度对肿瘤干细胞性具有一定的影响，其具体的作用和机制值得进一步深入研究。

5 基质硬度与糖代谢

癌细胞的生长速度异常增快，这需要更高的ATP水平来支持碳水化合物、蛋白质、脂质和核酸的生物合成。Tilghman等[24]研究发现，生长在较硬基质上的细胞表现出较短的细胞周期，细胞代谢活性增强，细胞内ATP水平升高，而肿瘤细胞ATP供应率和细胞增殖率成正比，这一现象提示ECM硬度不仅能够促进肿瘤细胞增殖，还可能调控其代谢活性。刘秋萍等[25]研究也发现，随着基质硬度增加，HepG2细胞增殖能力、葡萄糖摄取和Glut1（HepG2葡萄糖转运蛋白1）表达都显著增加。由此可见，肝癌细胞所处力学微环境对其增殖有重要影响，较高的基质硬度可能通过调控糖代谢途径促进肝癌细胞的增殖。

肿瘤ECM硬化和肿瘤细胞代谢重组是肿瘤进展的两个基本过程[26]。有证据表明，代谢方式变化发生在机械信号转导通路激活之后[27-28]。有氧糖酵解是包括肝癌细胞在内的大多数癌细胞的代谢标志，其特征是过度消耗葡萄糖和大量产生乳酸。在硬度较高的基质上培养的肝癌细胞葡萄糖消耗和乳酸产生都增加。因为癌细胞一般通过优先表达葡萄糖转运蛋白（例如Glut1）[29]和关键的糖酵解酶（例如HK II和LDHA）[30-31]来加速有氧糖酵解，如在硬度较高基质上培养的肝癌细胞系中观察到Glut1，HK II和LADH显著上调。一直以来，癌基因和抑癌基因的突变被认为可导致细胞内多个信号通路的改变，这些信号通路影响肿瘤细胞的新陈代谢，并促进肿瘤生存和生长。并且，许多致瘤信号通路可因基质硬度增加而激活[32]。例如，PI3K/AKT是调控肿瘤的有氧糖酵解的重要途径，并影响细胞增殖。而ECM的硬度增加会激活PI3K途径[33]。除了激活mTOR介导的信号外，PI3K通路还调节葡萄糖的吸收和利用。在不依赖胰岛素的组织中，PI3K信号可通过AKT调节葡萄糖转运蛋白Glut1和Glut4的表达，从而刺激磷酸果糖激酶活化并增加葡萄糖摄取[34]，这对增强有氧糖酵解至关重要。因此，PI3K调节PIP3以及随后激活AKT和mTOR，代表了基质硬度和ECM沉积的增加影响细胞新陈代谢。Liu等[35]发现，基质硬度作为MAPK信号轴的上游，激活MAPK的磷酸化，进而触发YAP的活化，从而调节糖酵解。Hu等[36]研究发现，基质硬度也可能通过影响p53基因来调节新陈代谢，因为AKT通过MDM2驱动p53基因的降解。

6 小结与展望

随着不同基质硬度体外平台的建立，生物力学得到了明显的发展，基质硬度对肝癌的影响越来越受到重视。但是，有些研究的结果出现明显差异，甚至是相互矛盾。因此，需要建立并完善更加符合生理环境的三维培养平台，制定更加优化和标准化的实验方法来研究基质硬度对肝癌细胞增殖及侵袭和转移的影响。随着研究的进一步深入，未来基质硬度可能有望成为判断肝癌预后的指标甚至成为有效的治疗靶点。