KRN7000的合成研究

郝玉伟，邢露匀，曹梦涵，毕晶晶

(河南师范大学 化学化工学院，河南 新乡 453007)

随着对肿瘤免疫认识和T细胞识别机制的突破性研究进展，神经鞘糖脂在肿瘤、肿瘤转移的诊治和预防中开辟了一条全新的免疫治疗途径[1-3]。1990年代初，日本麒麟啤酒有限公司从冲绳海绵Agelas Mauritianus的提取物中筛选出一系列鞘糖酯类化合物，并命名为Agelasphins (AGLs)[4]。它们是D-半乳糖以α-糖苷键与神经酰胺类化合物连接而成。其中α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer，KRN7000)作为明星分子，受到广泛关注[5-7]。研究表明α-GalCer具有抗肿瘤及激活免疫作用，能通过激活NKT细胞参与多种自身免疫性疾病、肿瘤、动脉粥状硬化和感染性疾病的免疫调节中，它作为抗癌新药已进入Ⅰ期临床研究阶段，是药物学家关注的重要免疫调节剂[8-9]。

KRN7000通常是由半乳糖基供体和神经酰胺受体通过糖苷反应构建骨架，进而脱除各种保护基而成。所以对于KRN7000的合成来说，需要构建糖基化反应的供体和受体两个模块。近年来，对KRN7000的合成研究主要有如下几种方法。如TAKIKAWA等[10]通过1-氟-2,3,4,6-四-氧-苄基-α-D-半乳吡喃糖与2-(N-二十六烷酰基氨基)-3,4-二-O-叔丁基二甲基硅基-植物鞘氨醇在SnCl4/AgClO4的催化下以四氢呋喃(THF)为溶剂在-10 ℃下进行偶联反应(收率为53%)。KIM等[11]通过2,3,4,6-四-氧-苄基-α-D-半乳吡喃糖施密特试剂与2-(N-二十六烷酰基氨基)-3,4-二-O-叔丁基二甲基硅基-植物鞘氨醇在三氟化硼乙醚(BF3·Et2O)的催化下，以THF-Et2O为溶剂在-20 ℃下进行偶联反应(收率为63%)。通过2,3,4,6-四-氧-苄基-α-D-半乳吡喃糖施密特试剂与2-(N-二十六烷酰基氨基)-3,4-二-O-苯甲酰基-植物鞘氨醇在三氟甲磺酸三甲硅酯(TMSOTf)的催化下，以THF-Et2O为溶剂在-23 ℃下进行偶联反应(收率为59%)。DU等[12]通过1-碘代-2,3,4,6-四-氧-苄基-α-D-半乳吡喃糖与2-叠氮基-3,4-二-O-对甲氧基苄基-植物鞘氨醇在四丁基碘化铵-N,N-二异丙基乙胺(TBAI-DIEA)的作用下以苯为溶剂在65 ℃下加热进行偶联反应。

以上方法用到的糖基供体为氟代糖、碘代糖或者施密特试剂，它们的稳定性相对较差，合成步骤长且复杂，不适合工业大批量合成，保存条件相对来说更加苛刻[13-15]。硫苷糖的稳定性相对较高，不易变质，很容易大批量合成和保存。且前三种方法需要在低温条件下进行偶联反应，第四种方法所用的受体需要将植物鞘氨醇的氨基进行叠氮化，偶联后得到α-GalCer骨架后还需要在经过氨基化、酰胺化和脱保护才能得到目标化合物。总体路线长，收率偏低。因此本研究尝试了一种新的合成路线，以2,3,4,6-四-氧-苄基-α-D-半乳吡喃糖硫苷作为一种稳定易得的糖基供体，与2-(N-二十六烷酰基氨基)-3,4-二-O-苯甲酰基-植物鞘氨醇在N-碘代丁二酰亚胺(NIS)/TMSOTf的作用下以二氯甲烷为溶剂在0 ℃下进行偶联反应，进而在甲醇钠的作用下脱除苯甲酰基，在H2，Pd(OH)2/C的作用下脱除苄基，即可获得KRN7000，总共3步，总收率达57.3%。

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

N-碘代丁二酰亚胺(北京百灵威科技有限公司)，二氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯(天津市德恩化学试剂有限公司)，0.4 nm分子筛、三甲基硅基三氟甲基磺酸酯、Pd(OH)2/C(北京伊诺凯科技有限公司)，三乙胺(天津市天力化学试剂有限公司)，Na2S2O3、甲醇钠(天津市天力化学试剂有限公司)，酸性树脂IR-120(郑州阿尔法化工有限公司)，以上药品均为分析纯。

R-1001VN旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)，核磁共振仪-Avance 400 MHz (瑞士布鲁克公司)，Bruker micro ToF II高分辨率质谱(德国布鲁克公司)，BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(郑州国瑞仪器有限公司)，ZF-20D暗箱式紫外分析仪(巩义市予华仪器责任有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1KRN7000的合成原理

以2,3,4,6-四-氧-苄基-α-D-半乳吡喃糖硫苷与2-(N-二十六烷酰基氨基)-3,4-二-O-苯甲酰基-植物鞘氨醇为起始原料，首先在NIS/TMSOTf的作用下通过糖基化反应得到偶联产物3，进而碱性条件脱除苯甲酰基，氢化脱除苄基，总共3步即可获得KRN7000，总收率高达57.3%。KRN7000的合成路线见图1。

图1 KRN7000的合成路线

1.2.2化合物3的制备

将糖基供体1(1.31 g，2.25 mmol，1.5 eq)、受体2(1.35 g，1.5 mmol)和N-碘代丁二酰亚胺 (675 mg，4.5 mmol，2 eq)溶于干燥的二氯甲烷(5 mL)中，加入0.4 nm分子筛。在0 ℃下搅拌10 min，快速加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯(TMSOTf，27 μL，0.15 mmol，0.1 eq)，反应液持续在0 ℃搅拌2 h。加入三乙胺中和反应体系，加入饱和Na2S2O3溶液，反应用二氯甲烷萃取3次，减压浓缩，所得浓缩物用柱色谱分离，得到化合物3(构型为α)，为无色液体(1.31 g，61%)。糖基化总收率为81%(α/β=3/1)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=8.03(d，J=7.2 Hz，2H)，7.92(d，J=7.2 Hz，2H)，7.59(t，J=7.2 Hz，1H)，7.51(t，J=7.2 Hz，1H)，7.45(t，J=7.2 Hz，2H)，7.38～7.29(m，10H)，7.27～7.17(m，12H)，7.03(d，J=9.2 Hz，1H)，5.70(dd，J=2.0，9.6 Hz，1H)，5.42～5.38(m，1H)，4.87(d，J=11.6 Hz，1H)，4.75～4.72(m，2H)，4.67～4.65(m，3H)，4.56～4.50(m，3H)，4.41(d，J=11.6 Hz，1H)，4.07(t，J=5.6 Hz，1H)，3.98(dd，J=2.0，10.4 Hz，1H)，3.94(dd，J=2.4，12.0 Hz，1H)，3.87～3.82(m，2H)，3.61(d，J=10.0 Hz，1H)，3.50(t，J=10.4 Hz，1H)，3.22(dd，J=5.6，9.2 Hz，1H)，2.16(t，J=7.6 Hz，2H)，1.91～1.87(m，2H)，1.64～1.60(m，2H)，1.26～1.20(m，68H)，0.88(t，J=6.0 Hz，6H)ppm；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ=173.1，166.1，165.3,138.8，138.4，138.3，137.8，133.2，132.8，130.2，130.0，129.8，128.5，128.3，128.2，128.1，128.0，127.9，127.7，127.6，127.5，127.4，127.3，100.1，78.7，75.0，74.7，73.9，73.5，73.2，72.8，72.3，70.3，70.0，69.1，48.6，36.7，31.9，29.7，29.6，29.5，29.4，29.3，28.4，25.7，22.7，14.1 ppm。

1.2.3化合物4的制备

将化合物3(830 mg，0.58 mmol) 溶于5 mL无水甲醇中，加入1 mol/L甲醇钠的甲醇溶液，调节pH值到9～10，然后在室温下搅拌3 h直到反应结束。加入酸性树脂IR-120中和，并加入过量的二氯甲烷使产物完全溶解，过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，所得浓缩物用快速柱色谱分离，得到化合物4为无色液体(660 mg，94%)。1H NMR(400 MHz，CD3OD/CDCl3=5/1)∶δ=7.39～7.26(m，20H)，6.40(d，J=8.4 Hz，1H)，4.94～4.85(m，3H)，4.80～4.73 (m，2H)，4.68(d，J=11.6 Hz，1H)，4.57(d，J=11.6 Hz，1H)，4.48(d，J=11.6 Hz，1H)，4.39(d，J=11.6 Hz，1H)，4.22(dd，J=3.6，8.0 Hz，1H)，4.05(dd，J=3.6，9.6 Hz，1H)，3.97(s，1H)，3.89～3.85(m，4H)，3.80(d，J=8.0 Hz，1H)，3.53～3.48(m，4H)，2.36(d，J=4.4 Hz，1H)，2.13(t，J=7.6 Hz，2H)，1.60～1.57(m，3H)，1.49～1.42(m，1H)，1.31～1.26(m，68H)，0.89(t，J=6.8 Hz，6H)ppm；13C NMR(100 MHz，CD3OD/CDCl3=5/1)δ=173.2，138.5，138.4，137.9，137.6，128.5，128.4，128.3，128.2，128.1，128.0，127.9，127.7，127.6，127.5，99.2，79.3，76.2，76.1，74.8，74.5，74.2，73.6，73.3，72.8，70.0，69.9，69.0，49.6，36.8，33.3，31.9，29.7，29.6，29.4，29.3，25.9，25.7，22.7，14.1 ppm。

1.2.4KRN7000的制备

2 结果与讨论

2.1 糖基化反应

此路线的关键步骤是糖基供体1和受体2之间的糖基化反应，我们对此步进行优化，首先在25 ℃进行反应的尝试，实验结果显示只有痕量的产物3生成。因此降温至0 ℃，收率能达到21%。由于半乳糖部分原料相对于植物鞘氨醇部分价格便宜得多，因此定化合物2为1个当量，通过增加化合物1、NIS及TMSOTf的当量，发现收率有所提高(入口2～5)。最后确定最佳糖基化条件为n(2)∶n(1)∶n(NIS)∶n(TMSOTf)=1∶1.5∶2∶0.1，温度0 ℃。

表1 投料比及温度对糖基化反应的影响

2.2 脱保护反应

最后一步脱除苄基的反应，我们尝试了几种溶剂，最终确定在二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中能定量反应，只需要过滤出氢氧化钯/碳，蒸干即得高纯度的目标化合物KNR7000。

表2 溶剂对脱苄基反应的影响

3 结论

本文开发了一条以2,3,4,6-四-氧-苄基-α-D-半乳吡喃糖硫苷和苯甲酰基保护的植物鞘氨醇为起始原料，依次通过酸催化的糖苷化反应、碱性条件脱除苯甲酰基和氢氧化钯/碳通入氢气脱除苄基得到药物分子KRN7000。其中硫苷作为稳定易得的糖苷供体，使得糖苷化反应变得温和、易于操作。此路线总共3步，总收率达57.3%。该路线具有原料易得、操作简单、收率高等优点，为KRN7000类似物的合成提供了一种新的方法。