组织因子在人胶质瘤组织中的表达水平及其临床意义

孙 莹，李相军，于鹏跃，姜一宁，宋燕珂，李 峣，汪 敏，赵丽艳*

(1.吉林大学第二医院 检验科，吉林 长春130041；2.吉林大学药学院 实验药理与毒理学教研室，吉林 长春130021；3.吉林大学第一医院 神经外科，吉林 长春130021)

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤，约占所有原发性脑瘤的30%，占所有恶性脑肿瘤的80%[1]，近年来的发病率呈不断升高趋势。目前的治疗方法包括外科切除、放疗和化学疗法的结合，但是患者术后极易复发，预后差。胶质瘤患者发生静脉血栓栓塞(VTE)的风险较高，尤其是高级别胶质瘤(WHO Ⅲ-Ⅳ级)患者，发生率高达17%-34%[2]。VTE的发生与胶质瘤患者的预后不良和生存率恶化密切相关[3]。在血栓形成的过程中，组织因子(TF)作为外源性凝血级联反应的启动因子，起着十分重要的作用。本研究利用免疫组织化学法检测了胶质瘤组织中TF的表达，探讨TF与VTE发生率的相关性，对胶质瘤患者合并VTE的风险评估有重要的参考价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

该研究获得了吉林大学第二医院和吉林大学第一医院伦理委员会的批准。选择2018年7月至2019年7月吉林大学第一医院收治的30例胶质瘤患者作为研究对象，男性15例，女性15例，年龄32-74岁，平均(51.83±11.39)岁。入选标准：(1)经影像学、病理明确诊断为胶质瘤；(2)初次发病、首次手术切除；(3)术前未接受放、化疗及其他治疗；(4)入组病例具有较完整的临床及病理学信息。排除标准：(1)合并其他病患，如自身免疫病、血液系统病、血友病等；(2)应用抗凝治疗或抗血小板治疗；(3)发生胶质瘤前有血栓病史；(4)有其他恶性肿瘤病史。所有患者均行手术切除，病理诊断明确肿瘤分级，收取其经手术切除的肿瘤脑组织标本。按WHO分级Ⅰ-Ⅱ级低级别胶质瘤组15例，Ⅲ-Ⅳ级高级别胶质瘤组15例。其中Ⅰ级毛细胞型星形细胞瘤2例，Ⅱ级少突星形细胞瘤5例，Ⅱ级少突胶质细胞瘤6例，Ⅱ级弥漫型星形细胞瘤1例，Ⅱ级多形性黄色星形细胞瘤1例，Ⅲ级间变型星形细胞瘤4例，Ⅳ级胶质母细胞瘤11例。并选择同期胶质瘤手术患者的癌旁正常脑组织标本8例作为对照组，患者年龄30-68岁，平均(47.13±13.17)岁。

1.2 主要试剂和仪器

兔抗人TF一抗购自中国Abclonal公司，QuickBlock封闭液购自中国碧云天生物技术公司，通用型试剂盒(小鼠/兔聚合物法检测系统)、DAB显色试剂盒、中性树胶购自北京中杉金桥生物技术公司，苏木素染液购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，ECLIPSE 80i正置显微镜购自日本尼康公司。

1.3 免疫组织化学染色法

按试剂盒说明书操作。在显微镜下以400×放大倍数拍摄切片，每张切片随机选取5个视野。使用Image J软件对TF蛋白表达进行半定量分析。半定量评分标准[4]如下：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3 分；阳性率0-5%为0分，5%-20%为1分，20%-45%为2分，>45%为3分。最终得分为染色强度和阳性细胞比例得分之积，0分为阴性(-)，1-3分为弱阳性(+)，4-6分为阳性(++)，7-9分为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 临床资料的分析

基线资料比较，高级别组和低级别组患者的年龄、性别和BMI无明显差异(P>0.05)，具有可比性。术前，高级别组PC、MPV、PT高于低级别组，高级别组MPV/PC、APTT低于低级别组，但差异无统计学意义(P>0.05)，高级别组FIB高于低级别组，差异有统计学意义(P<0.05)；术后，高级别组MPV和MPV/PC比值高于术前，差异有统计学意义(P<0.05)，低级别组PC低于术前，差异有统计学意义(P<0.05)，低级别组MPV/PC比值和FIB高于术前，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组胶质瘤患者血液学标志物的比较

2.2 TF在胶质瘤脑组织中的表达及与肿瘤组织学分级的相关性

结果显示，TF阳性产物表达于细胞膜或细胞质。对照组TF阳性率为3.24±1.21，以阴性为主，脑胶质瘤组织中TF阳性率为29.77±11.84，以阳性、强阳性为主，两组阳性率比较差异有统计学意义(P<0.0001)；低级别组TF阳性率为18.84±3.30，以阳性为主，高级别组TF阳性率为40.7±4.86，以强阳性为主，两组阳性率比较差异有统计学意义(P<0.0001)，见图1和表2。Spearman相关分析表明，TF表达与胶质瘤组织学分级呈正相关(rs=0.663，P<0.0001)。

注：(A)对照组；(B)低级别组；(C)高级别组

表2 不同WHO分级胶质瘤患者肿瘤脑组织中的TF表达比较(例)

2.3 TF与VTE的发生相关

随访期间，有6例低级别、12例高级别胶质瘤患者术后发生了VTE，并且低级别和高级别组中发生VTE患者的TF表达水平明显高于未发生VTE患者(P<0.01)，见表3。以是否发生VTE为因变量，Logistic回归分析显示，术前PC、MPV、PT、APTT和FIB与发生VTE不相关(P>0.05)；而TF阳性率与发生VTE有相关性(95%CI:1.043-1.594，P=0.019)。见图2。

表3 两组胶质瘤患者VTE的发生情况及对应的TF阳性率

图2 各因素与VTE之间的关联分析

3 讨论

肿瘤与凝血关系的研究一直被人们所关注。据报道，癌症患者VTE的发病率是普通患者的4-5倍[5]，这被认为是癌症患者死亡的高风险因素。一项前瞻性观察队列研究数据显示，对213例不同类型的原发性脑肿瘤患者(其中89%的患者患有高级别胶质瘤)随访2年期间，29例(13.6%)患者发生了VTE。VTE的6个月、12个月和24个月的风险分别为10.1%、13.3%和14.8%。血栓指数事件包括下肢深静脉血栓15例，肺栓塞13例，上肢深静脉血栓1例，其中有2例致死性肺栓塞[6]。VTE的发展与胶质瘤患者2年内死亡风险增加30%相关[7]。评估胶质瘤患者合并VTE的风险，制定相应的治疗策略，对改善胶质瘤患者的预后情况并延缓其生存时间，具有重要的临床意义。

血小板来源于骨髓造血组织中的巨核细胞产生，在止凝血中发挥着极为重要的作用。血小板参与静脉血栓的发生和发展主要是通过血小板胞质蛋白的释放作用于其临近的血细胞，促进TF、凝血酶等，以及血小板自身表面受体与血液细胞的相互作用[8-9]。本研究中高级别组术前FIB值高于低级别组，FIB水平升高可以促进血小板的聚集，有利于血栓的形成。高级别组与低级别组术后MPV/PC比值明显高于术前，说明外科手术后血栓风险增加。这是由于手术导致血管内膜受损，大量TF分泌入血，在启动外源性凝血途径的同时激活内源性凝血途径，使得凝血-抗凝系统失衡，加重脑胶质瘤病人血液高凝状态。有文献报道，胶质瘤患者术前可表现为血液高凝状态，并与术后VTE的发生呈正相关[10]，血液学标志物水平与胶质瘤组织学分级有关[11]。在本研究中，高级别组与低级别组术前PC、MPV、PT和APTT的比较虽然存在差异，但无明显统计学意义，这可能是由于本研究纳入的样本量不足所导致。

脑肿瘤合并VTE的病理生理机制尚不完全清楚，有学者提出了脑肿瘤合并VTE的风险与肿瘤细胞过度表达TF有关[12]。TF是外源性凝血级联反应的启动因子，通过与其配体FVII结合，形成TF-FVIIa复合物，激活FX，启动外源凝血途径，继而经过共同途径生成凝血酶，导致血小板活化和聚集，纤维蛋白生成，最终达到止血的目的[13]。同时，TF与FVIII和FIX激活的内源性凝血途径有关，有助于血栓的形成和扩大[14]。TF及其下游效应物的上调不仅导致凝血系统的激活，而且还参与调控对癌症进展至关重要的致癌信号机制[15]。本研究通过免疫组织化学检测胶质瘤患者脑组织标本中TF蛋白的表达情况，发现TF在脑胶质瘤组织中特异高表达，并与肿瘤组织学分级呈正相关，同时过表达TF的高级别胶质瘤患者其VTE发生率也明显升高。胶质瘤中TF表达增强的原因包括：①EGFR过表达，持续活化的EGFRvIII突变形式和HER2可诱导胶质瘤细胞TF基因的表达[16]；②PTEN丢失和VEGF过表达能够上调胶质瘤细胞的TF表达，而这两个分子事件也是从低级别胶质瘤向恶性胶质瘤转变的特征[17]；③缺氧[18]，在胶质母细胞瘤中，缺氧条件下TF蛋白和mRNA表达急剧增加，这可能与血管生成素-2介导的血管损伤有关。

通过对患者的电话随访，发现高级别胶质瘤病人机体比低级别胶质瘤病人机体更易处于血液高凝状态和发生血栓，在15例高级别胶质瘤患者中有12例发生了VTE。Logistic回归分析发现TF的表达与VTE的发生之间有关联，TF表达每增加1倍，发生VTE的风险增加1.289倍。TF在胶质瘤中的过表达及其与血栓形成的相关性，提示了TF在胶质瘤合并VTE的过程中扮演重要角色，并有可能成为预测和评估胶质瘤患者合并VTE风险的生物标志物。一项研究表明，IDH1突变胶质瘤中编码TF的F3基因呈高度甲基化和下调，而与IDH1野生型胶质瘤患者相比，IDH1突变胶质瘤患者的血栓形成显著减少[19]。同时，IDH1突变胶质瘤的侵袭性也比IDH1野生型胶质瘤小得多，阻断TF信号能够抑制IDH1野生型胶质瘤的增殖和侵袭，降低其发生VTE的概率[20]。此外，研究[21]发现TF能控制肿瘤休眠状态，并与炎症细胞和血管的募集共同起作用。TF的抑制使U373胶质瘤细胞在体内进入休眠状态长达一整年，而在TF表达后迅速恢复生长。本研究证实了TF在胶质瘤组织中的高表达及其与肿瘤组织学分级的相关性，探讨了在胶质瘤合并VTE中TF的重要贡献。鉴于TF在胶质瘤中的表达和胶质瘤发展中的作用，其作为评价胶质瘤患者合并VTE风险的生物标志物以及成为治疗胶质瘤靶点的潜能，有待更深入的研究。