Cu2+/Cd2+对玉米的急性毒性及其与重金属在根表形态分布的关系

董 歌，徐仁扣①

(1.中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室，江苏 南京 210008；2.中国科学院大学现代农学院，北京 100049)

重金属在土壤-作物系统内的迁移、富集及对生态环境的危害引起了全世界的高度关注[1]。玉米既是全球也是中国第一大谷物，在保障粮食安全和优化产业结构中占有重要地位[2]，然而农田土壤重金属污染引起的食品安全问题不容乐观。例如，在湖南严重污染的农田土壤上，19个玉米品种籽粒Cd质量含量范围为0.14～0.32 mg·kg-1，超标率达100%[3]。另外，玉米对Cu2+较为敏感[4]，易受Cu2+的毒害。因此，减缓玉米根系对Cu2+和Cd2+的吸收和积累具有重要实际意义。

植物根系表面带有丰富的官能团(—OH、—NH2和—H2PO4等)，质子的缔合与解离使其表面带有电荷，且以负电荷为主，可为阳离子提供潜在吸附位点[5]。根系主要通过形成化学键和静电吸引方式吸附重金属离子，植物种类和环境条件的改变会影响根系表面官能团类型，也会改变吸附位点数量和类型[6]，使得根系表面吸附重金属的化学形态发生变化并影响重金属在植物组织中的分布[4]。

土壤pH是影响重金属在土壤固液相分配的最重要因素[7]，可通过改变重金属形态影响重金属生物有效性，进而影响重金属的生物毒性和植物对其的吸收[8]。而外源阳离子和有机酸也会影响重金属的生物有效性。阳离子如Ca2+和Mg2+可与重金属阳离子竞争根系表面吸附位点，减少重金属在根系表面吸附量，进而缓解其毒性[9]。pH值为4.5时，Ca2+和Mg2+缓解小麦根系受Cu2+毒害的效果最佳[10]。植物在受重金属胁迫时会分泌有机酸，并通过有机酸与重金属形成可溶性络合物缓解其毒害[11]。有机酸羧基和羟基数目及其在碳链中的相对位置影响有机酸与Cu2+和Cd2+的络合能力[6]，进而影响其生物有效性。阳离子和有机酸对缓解玉米受重金属毒害的机制还有待探究。因此，笔者着重研究Cu2+和Cd2+的植物毒性及其与玉米根系表面电化学性质和重金属形态分布的关系，研究结果可为修复重金属污染土壤和保障食品安全提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及生长条件

供试玉米品种为苏玉20，购于江苏省农业科学院。将玉米种子置于φ=10%的H2O2溶液中消毒10 min后，冲洗干净，在蒸馏水中浸泡4 h，播于垫有湿滤纸的培养皿中，再放入恒温培养箱〔温度为(25±2) ℃，相对湿度为70%〕中在黑暗条件下催芽48 h。最后，挑选露白的种子在人工生长室〔14 h光照，27 ℃/10 h黑暗，20 ℃；光照强度(以光子计)为375 μmol·m-2·s-1；相对湿度为70%〕中水培2 d，再转移至营养液(pH值为4.5)中进行培养。

营养液组分(mmol·L-1)：(NH4)2SO4，2.0；NaNO3，12.0；NaH2PO4·2H2O，1.0；K2SO4·5H2O，3.0；MgSO4·2H2O, 3.0；CaCl2，4.0。营养液其他组分(μmol·L-1)：MnCl2·4H2O，9.15；CuSO4·5H2O，0.32；ZnSO4·7H2O，0.77；(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.02；H3BO3，46.26；FeSO4·7H2O-EDTA， 20.0。每2 d更换1次营养液，第15天时取根系分别用于Cu2+和Cd2+吸附试验。

1.2 玉米根伸长抑制试验

玉米根伸长试验参照ISO标准(11269-1)[12]。取培养48 h后的玉米幼苗分别置于含0.5 mmol·L-1CaCl2以及0.5、1、2、5、10、20、40、60和80 μmol·L-1Cu(NO3)2或Cd(NO3)2溶液(pH值为4.5)中，每个处理10株幼苗，重复3次，暗培养48 h，采用式(1)计算根系相对伸长率(E)：

E=(T2-T1)/(C2-C1)×100%。

(1)

式(1)中，C1为对照处理前根长，cm；C2为对照处理48 h后根长，cm；T1为重金属处理前根长，cm；T2为重金属处理48 h后根长，cm。

当研究不同阳离子对玉米根系受重金属毒害的影响时，选定Cu(NO3)2和Cd(NO3)2溶液浓度为40 μmol·L-1，溶液中还含有0.5 mmol·L-1CaCl2背景电解质及1或2 mmol·L-1KCl、NH4Cl、CaCl2和MgCl2，其他试验条件同上。

当研究不同有机酸对玉米根系受重金属毒害的影响时，选定Cu(NO3)2和Cd(NO3)2溶液浓度为40 μmol·L-1，溶液还含0.5 mmol·L-1CaCl2背景电解质及1 mmol·L-1草酸、柠檬酸、酒石酸或苹果酸，其他试验条件同上。

1.3 Cu2+和Cd2+吸附/解吸试验

将生长15 d的玉米根系置于去离子水中浸泡1 h，旨在去除根系表面多余的养分离子。再将根与茎分离，用蒸馏水清洗3次，用滤纸小心吸干其根系表面水分。取约10 g鲜根装在0.05 mm孔径尼龙网袋中，在磁力搅拌条件下将根与1 L含40 μmol·L-1Cu(NO3)2或Cd(NO3)2溶液反应2 h，取出并用去离子水清洗3次，吸干表面水分，然后依次将根系置于500 mL 0.1 mol·L-1KNO3、0.05 mol·L-1EDTA溶液(pH为6.0)和0.01 mol·L-1HCl溶液中1 h，分别提取植物根系表面吸附的交换态、络合态和沉淀态重金属离子[6]。最终将浸提过的根系清洗后，置于温度为50 ℃烘箱中烘干至恒重。采用原子吸收分光光度法测定提取液中Cu2+和Cd2+含量。

当研究不同阳离子对玉米根系吸附重金属的影响时，配制含40 μmol·L-1Cu(NO3)2或Cd(NO3)2及1 mmol·L-1KCl、NH4Cl、CaCl2或MgCl2的混合液，溶液pH为4.5。将根系分别置于该混合液中吸附2 h后，用上述浸提液依次提取交换态、络合态和沉淀态Cu2+和Cd2+。

当研究不同有机酸对玉米根系吸附重金属的影响时，配制含40 μmol·L-1Cu(NO3)2或Cd(NO3)2及1 mmol·L-1草酸、柠檬酸、酒石酸或苹果酸的混合液，溶液pH为4.5。其他步骤同上。

当研究不同pH值对玉米根系吸附重金属的影响时，配制含40 μmol·L-1Cu(NO3)2或Cd(NO3)2溶液，调节溶液pH值分别至4.0、4.5和5.0。其他步骤同上。

1.4 根系表面Zeta电位的测定

取约10 g玉米鲜根，与初始浓度为40 μmol·L-1Cu2+和Cd2+溶液反应2 h，以蒸馏水为对照。反应过程中控制pH保持恒定为4.5。吸附完成后，用蒸馏水清洗根系3次，擦去多余水分，风干，再用流动电位法测定根系Zeta电位[13]。具体做法：将风干根剪成2 cm长，取0.25 g填充样品池，用稀盐酸和稀氢氧化钠调节1.5 L流动液pH分别为3.76、4.65、5.50、6.86和7.66，再用NaCl调节溶液电导率为80 μS·cm-1；将流动液泵入测量池后平衡90 min，更换不同pH流动液在最大流量下平衡10 min后测量流动电位ΔE和测量池两端的液压差ΔP，用Helmholtz-Smoluchowski方程计算Zeta电位(ζ)[14]：

(2)

式(2)中，ΔE为流动电势，mV；ΔP为液体压力差，Pa；μ为溶液的粘滞系数，Pa·S；ε为电解质溶液的介电常数，F·m-1；ε0为真空介质的介电常数，F·m-1；κ为溶液电导，S·m-1。

1.5 数据处理

试验数据以平均值±标准误差表示，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0进行数据处理和LSD多重分析(P<0.05)，并进行差异显著性检验，采用字母标记法进行标记。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度Cu2+和Cd2+胁迫对玉米根系伸长的影响

由图1可知，在pH为4.5条件下，玉米根系相对伸长率随着Cu2+和Cd2+浓度的升高而显著下降，Cu2+和Cd2+浓度分别与含该重金属溶液中玉米根相对伸长率呈显著负相关，相关系数分别为-0.571和-0.710(P<0.05)。上述结果表明Cu2+和Cd2+对根系的毒害抑制根系生长，且这种毒害随重金属浓度的升高而增大。当Cu2+和Cd2+浓度均为40 μmol·L-1时，玉米根系的伸长均趋于停止，故选此浓度研究不同阳离子和不同有机酸对玉米幼苗根系伸长的影响。图1还表明，当Cu2+和Cd2+浓度相同时，玉米幼苗在含Cu2+营养液中的根系相对伸长率明显低于含Cd2+营养液中的根系，例如，当Cu2+和Cd2+浓度均为1 μmol·L-1时，玉米根系相对伸长率分别为52.40%和96.23%。这说明Cu2+对玉米根系生长的抑制作用大于Cd2+，因为前者对植物的毒性大于后者[15]。

2.2 pH对玉米幼苗根表吸附的Cu2+和Cd2+形态分布的影响

重金属离子与根系表面结合后才会对根系产生毒害。将玉米根系吸附的Cu2+和Cd2+区分为交换态、络合态和沉淀态[16]。交换态指由于静电引力作用而吸附于根表面负电荷位上的重金属离子，络合态指与根系表面官能团形成表面络合物的重金属，沉淀态指以物理方式附着在根系表面的金属氢氧化物和氧化物沉淀。由图2可知，吸附在玉米根系表面的Cu2+主要以交换态和络合态存在，当pH为4.5和5.0时，沉淀态Cu2+含量较低；而吸附在玉米根系表面的Cd2+主要以交换态存在，络合态和沉淀态含量均较低。Cu2+与有机官能团之间的络合能力比Cd2+与有机官能团之间的络合能力强，这是玉米根系表面络合态Cu2+含量高于络合态Cd2+的主要原因[6]。当pH值相同时，玉米根系表面吸附的交换态和沉淀态Cu2+含量也明显高于相应形态的Cd2+。例如，当pH为4.5时，交换态、络合态和沉淀态Cu2+含量分别是相应形态Cd2+含量的1.22、4.36和2.45倍。由于玉米根系对Cu2+的吸附亲和力和吸附量均高于其对Cd2+，因此Cu2+对玉米根系生长的抑制作用大于Cd2+。

随着pH的升高，玉米根系表面吸附的交换态和络合态Cu2+含量均显著增加(P<0.05)，其吸附的交换态和络合态Cd2+含量也均显著增加(P<0.05)(图2)。植物根系表面负电荷主要来源于羧基和酚羟基等官能团的离解，随着介质pH升高，这些官能团的离解度增加，根系表面负电荷增加，对重金属阳离子的静电吸附量增加，这是玉米根系表面交换态Cu2+和交换态Cd2+随pH升高而增加的主要原因。玉米根系Zeta电位的测定结果证明了根系表面负电荷随pH的这一变化趋势(图3)，结果表明玉米根系Zeta在所研究的pH为3.8～7.7范围内均为负值，说明在这一pH范围内玉米根系带净负电荷；随着介质pH升高，玉米根系Zeta电位绝对值增加，说明根系表面负电荷增多。重金属阳离子主要与根系表面有机阴离子形成络合物，随着pH升高，根系表面阴离子数量增多，与Cu2+和Cd2+形成表面络合物的数量相应增加。Zeta电位测定结果也为Cu2+和Cd2+在玉米根表面形成表面络合物提供了证据。根据表面化学原理，阳离子的静电吸附不改变吸附剂表面电荷，但阳离子的专性吸附使吸附剂表面负电荷减少，吸附剂的Zeta电位也发生相应变化。图3显示，与没有吸附重金属的对照相比，吸附了Cu2+和Cd2+的玉米根系Zeta电位-pH曲线向正值方向位移，且吸附Cu2+的玉米根系Zeta电位-pH曲线位移更显著，说明Cu2+和Cd2+与玉米根系表面官能团形成了表面络合物，且Cu2+与根表的络合作用大于Cd2+，此与图2结果一致。图3还表明，吸附Cu2+的玉米根系Zeta电位-pH曲线与对照之间的差值也随介质pH的升高而增大，此与根表络合态Cu2+的量随pH升高而显著增加的结果一致，说明根系吸附的络合态Cu2+数量越多，根系表面电荷的变化越大。

玉米根系表面吸附的沉淀态Cu2+含量在pH为4.5条件下达到最高，在pH为5.0条件下有所下降；沉淀态Cd2+含量随pH升高而增加，但在pH为4.5～5.0之间时无显著差异。随pH升高，沉淀态Cu2+和Cd2+含量增加是2种金属离子的水解作用增强所致。因为Cu2+的水解能力比Cd2+强，它们的水解常数pK分别为6.5和9.7[17]，这是相同pH条件下玉米根表沉淀态Cu2+含量高于沉淀态Cd2+含量的主要原因。

2.3 不同种类阳离子对玉米根系受Cu2+和Cd2+毒害的缓解作用与机制

不同价态养分阳离子能够缓解玉米幼苗根系受Cu2+和Cd2+的毒害，当K+、NH4+、Mg2+和Ca2+与Cu2+或Cd2+共存时玉米根系相对伸长率大于单一Cu2+或Cd2+体系(图4)。4种阳离子在1和2 mmol·L-12个浓度水平下均对Cd的毒性有显著缓解作用，但只有Mg2+和Ca2+对Cu的毒性有显著缓解作用，K+、NH4+对Cu毒性缓解作用不显著。4种阳离子对Cd2+植物毒性的缓解作用大于其对Cu2+。例如，与Cu2+单一胁迫的根系相比，1 mmol·L-1NH4+、K+、Ca2+和Mg2+使玉米根系相对伸长率分别增加0.48、0.48、8.44和3.32百分点；对Cd2+胁迫体系4种阳离子使玉米根系相对伸长率分别提高3.42、1.53、13.19和4.26百分点。4种阳离子对Cu2+和Cd2+毒性的缓解作用由大到小依次为Ca2+>Mg2+>NH4+≥K+。

研究不同种类阳离子对玉米根表吸附Cu2+和Cd2+及其形态分布的影响(图5)，结果表明共存阳离子均降低了玉米根表对3种形态Cu2+和Cd2+的吸附量，二价阳离子的影响效果达到显著水平。例如，与单一重金属处理相比，Ca2+使交换态和络合态Cu2+含量分别降低69.06%和77.55%，使交换态和络合态Cd2+含量分别降低93.00%和84.75%；Mg2+使交换态和络合态Cu2+含量分别降低60.66%和72.73%，使交换态和络合态Cd2+含量分别降低55.6%和38.82%。共存阳离子主要通过与重金属阳离子竞争根表吸附位点来减少玉米根系对Cu2+和Cd2+的吸附，带负电荷的根表对二价阳离子的静电吸引力大于一价阳离子，这是相同浓度条件下Ca2+和Mg2+对根系吸附Cu2+和Cd2+的抑制作用大于K+和NH4+的主要原因。

共存阳离子Ca2+、Mg2+、K+和NH4+抑制了玉米根系对Cu2+和Cd2+的吸附，从而缓解了2种重金属对玉米根系的毒害(图4)。随着共存阳离子浓度的升高，它们对根系吸附Cu2+和Cd2+的抑制作用增加，相应地对2种重金属毒性的缓解作用也增强，这与对大麦的相关研究结果[9]相一致。

2.4 不同种类有机酸对玉米根系受Cu2+和Cd2+毒害的缓解作用与机制

图6显示，1 mol·L-1有机酸显著缓解玉米幼苗根系受Cu2+和Cd2+的毒害，其缓解作用由强到弱为草酸>柠檬酸>酒石酸≈苹果酸。与单一重金属处理相比，草酸、柠檬酸、酒石酸和苹果酸分别使玉米根系受Cu2+胁迫时的相对伸长率增加4.44、2.49、2.22和1.27倍，使玉米根系受Cd2+胁迫时的相对伸长率增加2.06、1.78、1.59和1.44倍。

有机酸也主要通过抑制玉米根系对Cu2+和Cd2+的吸附来缓解重金属对根系的毒性。当有机酸与Cu2+或Cd2+共存时，玉米根系吸附的交换态、络合态和沉淀态Cu2+和Cd2+含量均有不同程度的减小(图7)。与单一Cu2+处理相比，添加草酸、柠檬酸、苹果酸和酒石酸分别使玉米根表交换态Cu2+含量降低91.34%、88.65%、74.38%和73.86%，使络合态Cu2+分别降低96.13%、80.60%、58.82%和52.96%。与单一Cd2+处理相比，添加草酸、柠檬酸、苹果酸和酒石酸分别使玉米根表交换态Cd2+含量降低62.13%、48.21%、40.31%和46.72%，分别使络合态Cd2+含量降低57.56%、28.37%、20.33%和27.20%。4种有机酸对玉米根系吸附Cu2+和Cd2+抑制作用的大小顺序与它们对玉米根系受2种重金属毒害的缓解作用的大小顺序一致。

在玉米根系受Cu2+和Cd2+短期胁迫时，有机酸通过与2种重金属阳离子形成络合物使其保留在溶液中，从而减小根系对重金属阳离子的吸附量，减轻2种重金属对根系的毒害。有机酸这2种作用的强弱主要取决于它们与重金属阳离子络合作用的强弱，络合作用的强弱一般用络合稳定常数(lgK稳)表征。柠檬酸、酒石酸和苹果酸与Cu2+形成络合物的稳定常数分别为5.90、3.20和3.42，与Cd2+形成络合物的稳定常数分别为3.12、2.80和2.36[18]，与这3种有机酸抑制玉米根系吸附2种重金属阳离子的大小顺序及缓解重金属对根系毒性的大小顺序基本一致。虽然草酸与2种重金属阳离子形成络合物的稳定常数(4.84和2.75)小于柠檬酸，但草酸的酸离解常数pKa1(1.25)也小于柠檬酸(3.13)，因此，相同pH和有机酸浓度条件下，草酸体系比柠檬酸体系含有更多的有机阴离子，更有利于络合物的形成。这是草酸对玉米根系吸附Cu2+和Cd2+的抑制作用及对2种重金属毒性的缓解作用大于柠檬酸的主要原因。因此，有机酸与重金属阳离子的络合作用越强，它对植物根系吸附重金属阳离子的抑制作用就越大，它缓解植物受重金属毒害的效果就越显著。

3 结论

(1)Cu2+和Cd2+通过在玉米根系表面的吸附对根系产生毒害并抑制根系生长，带负电荷的根系表面对Cu2+的吸附亲和力大于其对Cd2+，因此相同条件下Cu2+对根系的毒害大于Cd2+。

(2)Ca2+、Mg2+、K+和NH4+等共存阳离子通过与Cu2+和Cd2+竞争玉米根系表面的吸附点位而抑制根系对重金属阳离子的吸附，从而缓解2种重金属对根系的毒害。4种阳离子缓解根系受Cu2+和Cd2+毒害的作用由大到小依次为Ca2+、Mg2+、K+和NH4+，与这些阳离子竞争根系表面吸附位点的能力大小相一致。

(3)低相对分子质量有机酸主要通过与Cu2+和Cd2+形成络合物抑制2种重金属阳离子在根系表面的吸附，从而缓解玉米受2种重金属的毒害作用。4种有机酸缓解重金属毒性的作用由大到小依次为草酸>柠檬酸>酒石酸≈苹果酸，这与上述有机酸络合Cu2+和Cd2+的能力大小顺序基本一致。