东莞地区早产儿氨基酸代谢水平的分析

谢彩连 陈锦国 蔡小娟 钟玉杭

【摘要】 目的：運用串联质谱技术分析东莞地区早产儿氨基酸代谢水平的变化特点。方法：选取2019年1-12月于东莞市出生的3 381例早产儿（早产儿组）和3 845例正常足月儿（正常足月儿组），并将早产儿组按不同出生体质量分为极低出生体重儿、低出生体重儿和单纯早产儿。采用串联质谱技术检测滤纸干血斑中9种氨基酸的浓度。比较早产儿与正常足月儿的氨基酸代谢水平的差异，分析三组不同出生体质量早产儿氨基酸代谢水平的变化特点。结果：早产儿组丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）浓度均明显低于正常足月儿组，而瓜氨酸（Cit）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）浓度均明显高于正常足月儿组（P<0.05）。早产儿组中不同出生体质量早产儿9种氨基酸代谢水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。其中Ala、Gly、Tyr浓度随着出生体质量的增加而升高，Cit、Phe浓度随着出生体质量的增加而降低。采用百分位数法，选择双侧限值的可信区间（P2.5～P97.5）建立早产儿的氨基酸参考范围。结论：早产儿氨基酸代谢水平与正常足月儿存在明显差异，早产儿不同出生体质量可影响其体内氨基酸代谢浓度的分布。建议新生儿筛查实验室根据不同出生体质量建立早产儿氨基酸的参考范围，同时为临床早产儿合理的营养补充提供参考依据。

【关键词】 早产儿 氨基酸 串联质谱 代谢水平

Analysis of Amino Acid Metabolism Level of Premature Infants in Dongguan Area/XIE Cailian， CHEN Jinguo， CAI Xiaojuan， ZHONG Yuhang. //Medical Innovation of China， 2021， 18（33）： 0-086

[Abstract] Objective： To analyze the changes in amino acid metabolism of preterm infants in Dongguan by tandem mass spectrometry. Method： A total of 3 381 preterm infants （preterm infants group） and 3 845 normal term infants （normal term infants group） who born in Dongguan City from January to December 2019 were selected， the preterm infants group was divided into very low birth weight infant， low birth weight infant and simple premature infant according to different birth weights. The concentration of 9 amino acids in dried blood spots on filter paper was detected by tandem mass spectrometry. The amino acid differences between preterm infants group and normal term infants group were compared， and the amino acid metabolism characteristics of three groups of preterm infants with different birth weights were analyzed. Result： The concentrations of alanine （Ala）， glycine （Gly）， proline （Pro） and valine （Val） in preterm infants group were significantly lower than those in normal term infants group， while the concentrations of citrulline （Cit）， methionine （Met）， phenylalanine （Phe） and tyrosine （Tyr） were significantly higher than those in normal term infants group （P<0.05）. The comparison of 9 amino acid metabolism levels of preterm infants with different birth weights in preterm infants group were statistically significant （P<0.05）. Among them， the concentrations of Ala， Gly， and Tyr increased with the increase of birth weight， while the concentrations of Cit and Phe decreased with the increase of birth weight. The percentile method was used to select confidence interval （P2.5-P97.5） of the two-sided limit to establish the amino acid reference range for preterm infants. Conclusion： The amino acid metabolism level of preterm infants is significantly different from that of normal term infants， different birth weights of preterm infants can affect the amino acid metabolism concentration in their bodies. It is recommended that newborn screening laboratories establish a reference range for preterm infants based on different birth weights， and provide a reference for reasonable nutritional supplementation for clinical preterm infants.

[Key words] Premature infants Amino acids Tandem mass spectrometry Metabolic level

First-author’s address： Dongguan Maternal and Child Health Hospital， Dongguan 523000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.33.021

遺传代谢病是指由于基因突变导致维持机体正常代谢所必需的某些酶、受体或载体等的缺乏，从而导致机体代谢紊乱继而出现相应临床症状的一类疾病[1]。新生儿遗传代谢病的筛查主要通过串联质谱技术检测干血片的氨基酸和肉碱的浓度，根据其代谢水平来判断是否存在代谢障碍，能在患儿未出现临床症状或症状早期及时发现、及早诊断和治疗。与传统筛查方法相比，串联质谱技术具有快速、灵敏、高通量、高特异性等特点，随着筛查技术的普及和筛查人群的扩大，该方法的假阳性率也在增加[2]，另有研究表明由于早产儿或低体重儿参与代谢的重要器官发育还尚未成熟与完善，体内多种氨基酸和肉碱存在代谢异常，从而导致筛查假阳性率亦升高[3]。本研究运用串联质谱技术了解东莞地区早产儿的氨基酸代谢水平，探讨早产儿与足月儿氨基酸代谢水平的差异，研究不同出生体质量对早产儿的氨基酸代谢水平的影响，并初步建立早产儿的特异性参考范围，提高筛查准确性，降低假阳性率，同时为临床医生在早产儿的个性化营养支持策略提供参考依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从2019年1-12月在东莞市出生并接受遗传代谢病串联质谱筛查的56 438例新生儿中，选取3 381例活产早产儿作为早产儿组，将早产儿组按不同出生体质量分为极低出生体重儿（<1 500 g）179例、低出生体重儿（1 500～2 499 g）1 588 例、单纯早产儿（≥2 500 g）1 614例。同时随机选取同期的正常足月新生儿3 845例作为正常足月儿组。早产儿组纳入标准：妊娠不满37周的活产新生儿;出生后一般情况良好;无严重的先天缺陷和遗传代谢疾病;无围生期窒息史。早产儿组排除标准：筛查基本资料不全。正常足月儿组纳入标准：同期出生的健康活产新生儿（孕周≥37周且体重≥2 500 g）;无严重出生缺陷和遗传代谢疾病。正常足月儿组排除标准：筛查基本资料不全。本研究已获得医院医学伦理委员会的批准，所有标本的采集和检测均由新生儿监护人签署知情同意书。

1.2 标本的采集与递送 新生儿出生48～72 h后并充分哺乳8次以上，特殊原因（提前出院、早产、疾病等）未及时采血者可延迟采血，但最迟不宜超过生后20 d。采血部位选择足跟内、外侧缘，血滴于S&S903专用采血滤纸的筛查卡片上。要求采集4个血斑，每个血斑直径不小于8 mm、背面渗透完好。血片在室温自然晾干后密封保存于2～8 ℃冰箱，由本中心派专员每周上门两次收取标本，全程冷链递送。

1.3 仪器和检测方法

1.3.1 仪器 采用美国ABI公司的API3200串联质谱仪、日本岛津公司LC-20AD高效液相色谱仪。

1.3.2 检测方法 使用手动打孔器取直径3 mm的血斑于96孔聚丙烯板中，每孔加入100 μL含氨基酸和酰基肉碱同位素内标液的日常工作液，用黏性封膜覆盖微孔板以减少挥发，置于温度为45 ℃、振荡速度为650 r/min的孵育器中振荡45 min。然后取出75 μL溶液至96孔V型底、耐热微孔板内，用铝箔封套好后置入自动进样器进行检测。

1.4 数据分析 采用美国ABI公司ChemoView 2.0软件，根据已知浓度的内标物和目标分析物的离子峰强度，可直接换算得出待测标本氨基酸的浓度及相应的比值。氨基酸参考范围的建立采用百分位数法，取双侧限值P2.5～P97.5的值作为参考区间，用“P2.5～P97.5”表示。

1.5 统计学处理 采用SPSS 23.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组平均胎龄和平均出生体质量比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 两组氨基酸代谢水平比较 早产儿组丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）浓度均低于正常足月儿组，而瓜氨酸（Cit）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）浓度均高于正常足月儿组（P<0.05）;两组亮氨酸（Leu）浓度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 早产儿组不同出生体质量早产儿氨基酸代谢水平比较 早产儿组不同出生体质量早产儿9种氨基酸代谢水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。Ala、Gly、Tyr浓度随着出生体质量的增加而升高，Cit、Phe浓度随着出生体质量的增加而降低，Leu、Met、Pro、Val浓度在极低出生体重儿组明显降低。见表3。

2.4 不同出生体质量早产儿氨基酸参考范围 不同出生体质量早产儿氨基酸参考范围，见表4。

3 讨论

近年来，国家对出生缺陷的防控愈加重视，而新生儿疾病筛查是预防出生缺陷的第三道防线，是降低出生缺陷和提高出生人口素质的有力举措。串联质谱技术应用于新生儿遗传代谢病筛查以来，大大扩展了疾病的筛查谱，实现了遗传代谢病筛查领域的重大突破，一次实验即可检测多达40余种遗传代谢病，包括氨基酸代谢病、有机酸代谢病和脂肪酸氧化障碍等，大幅度提高了筛查效率。随着串联质谱技术的日益成熟和不断的推广普及，近年来已成为生物、医学、制药等领域的重要分析方法，特别在新生儿遗传代谢病筛查的应用得到业界的一致认可。该技术能在遗传代谢性疾病的早期诊断和正确治疗提供可靠的依据，大大降低了患儿的致残率和病死率，减轻家庭和社会的负担[4]。

氨基酸作为蛋白质的基本组成单位，是新生儿营养的重要成分之一，其在蛋白合成、能量供给、生理功能的调节以及促进生长发育等方面都发挥着不可或缺的作用。近些年，随着经济水平的不断提高和医疗技术的飞速发展，早产儿的存活率逐渐提高[5]，关注早产儿的早期生存质量及远期健康发展已成为新生儿领域的重点方向，越来越多的专家学者对早产儿氨基酸代谢方面进行研究[6-7]。本研究运用串联质谱技术对早产儿和足月儿氨基酸代谢水平进行比较，发现大多数早产儿的氨基酸代谢水平与足月儿存在显著差異，早产儿组丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）浓度均低于正常足月儿组（P<0.05）。氨基酸的代谢水平在一定程度上揭示了体内的营养代谢状态，低浓度的氨基酸水平侧面反映了早产儿氨基酸的合成能力不足及低效率的营养吸收[8]。这可能与早产儿的胎盘氨基酸转运功能不成熟有关[9]。甘氨酸的内源性需求很高，特别在病情危重或补充氧气等应激状态下需求可能增加，但早产儿可能无法充分合成和吸收这种氨基酸，导致其水平随着早产的增加而下降;脯氨酸参与细胞生物化学及生理功能的调节，同时在肠道免疫系统中起重要作用[10]。

本研究结果显示，早产儿组瓜氨酸（Cit）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）浓度均高于正常足月儿组（P<0.05）。这与YANG等[11]的报道相似，他们发现早产儿低出生体重组的苯丙氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸浓度均高于正常对照组。另外，易芳等[12]也证实与正常足月儿相比，小于胎龄儿的甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的浓度更高。由于早产儿体内参与蛋白质代谢的重要器官发展缓慢，其对应的代谢酶不活跃或合成相对不足，容易造成氨基酸过量或缺乏。苯丙氨酸的浓度升高可能是早产儿肝脏的正常代谢模式尚未完全建立起来，苯丙氨酸羟化酶活性降低或轻度延迟，从而引起的暂时性升高。而4-羟基苯基丙酮酸氧化酶不成熟可导致早产儿酪氨酸浓度升高，胱硫醚酶活性降低则导致甲硫氨酸浓度的升高[13]。

本研究结果显示，早产儿大多数氨基酸代谢浓度随着出生体质量的变化而发生相应的改变，早产儿组不同出生体质量早产儿9种氨基酸代谢水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。Ala、Gly、Tyr浓度随着出生体质量的增加而升高，Cit、Phe浓度随着出生体质量的增加而降低，Leu、Met、Pro、Val浓度在极低出生体重儿组明显降低。值得注意的是，当出生体质量越低时这种差异越明显，但随着出生体质量的增加，大多数氨基酸浓度趋向接近于健康足月新生儿的水平，由此推测早产儿出生体质量可影响其体内氨基酸浓度的分布。YANG等[14]在调查2 159例早产儿氨基酸值变化的初步研究中也观察到这一现象;王淮燕等[15]在探讨1 992例早产儿的全血氨基酸代谢变化特征的研究中也得出相同结论：出生体质量对新生儿氨基酸代谢水平的分布具有重要影响。因此，在评估新生儿氨基酸代谢水平时，尤其是低出生体重的早产儿，应充分考虑出生体质量这个重要的干扰因素[16]。

本研究选取2019年1-12月于东莞地区出生的3 381例早产儿，根据不同出生体质量初步建立极低出生体重儿、低出生体重儿和单纯早产儿的分级参考范围，以供临床评估参考。临床对疾病的诊断、预后的判断、治疗效果的评估均取决于可靠的参考范围[17]。目前，国内尚无基于多中心、大数据的临床样本研究来建立早产儿的氨基酸参考范围。本研究的标本量尚显不足，今后将进一步积累更多的研究样本数，并通过长期随访进行样本验证，不断加以优化早产儿的参考范围，以评估其在临床的适用性。

众所周知，肠外营养常用于改善早产儿的营养状况，以保证其正常生长发育所需的营养物质，是提高早产儿存活率的关键措施。Heimler等[18]发现，早期接受肠外营养的早产儿氨基酸浓度接近于体重较大的早产儿，这表明早产儿的氨基酸浓度可能受肠外营养补充的影响。这是本研究存在的局限性，未将此因素考虑在内，可能存在一小部分早产儿在补充肠外营养后采血进行遗传代谢病的筛查。由于本中心承担整个东莞市的新生儿疾病筛查工作，采血单位送检时可能未注明早产或低出生体重儿的一些特殊信息，如疾病情况、用药情况、肠外营养输注等。今后，将完善早产儿这一特殊群体的信息登记管理，以便于筛查结果的判读。但笔者发现，即使存在肠外营养的影响，早产儿的多种氨基酸浓度仍然显著降低。

综上所述，东莞地区早产儿的氨基酸代谢水平与正常足月儿存在显著差异，出生体质量是影响氨基酸水平分布的重要因素。串联质谱技术是评估早产儿氨基酸代谢水平的重要且可靠的方法，实验室可根据不同出生体质量来建立早产儿的特异性参考范围，以此降低筛查假阳性率的发生，提高筛查的准确性，同时为临床制定早产儿营养策略提供参考依据。

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（收稿日期：2021-03-29） （本文编辑：程旭然）