DNA微阵列芯片技术检测培阳肺结核患者痰样本中结核分枝杆菌耐药性的价值

王 悦，孙 颖，孙炳奇

结核病(TB)位居全球单一致死性传染病的首位(排在HIV/AIDS之前)，每年约有50万利福平耐药病例，其中78%为耐多药结核病(MDR-TB)。我国是全球耐药结核病负担最大的3个国家之一。异烟肼(INH)和利福平(RIF)的广泛使用及菌体基因突变加剧了耐药性的发生[1-3]。实际工作中，由于传统的药敏试验方法费时、繁琐，无法满足快速临床诊断的要求[4-5]。目前，许多快捷高效的分子技术已成功应用于MTB检测，包括实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、线性探针耐药检测分析(LPAs)和寡核苷酸或DNA微阵列等。

DNA微阵列技术(基因芯片耐药基因检测技术)是指在rpoB、inhA和katG基因的特定位置结合特异性核苷酸，检测痰标本中MTB对于利福平和异烟肼的耐药情况。

本研究以MGIT 960药敏试验为参考标准，验证芯片法对MDR-TB的检测能力。对于芯片法与液体药敏检测不一致的结果，采用WHO推荐的线性探针耐药检测法进行复核，以期客观的探讨芯片法对培阳结核病患者的耐药性的检测能力。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1研究对象 收集沈阳市第十人民医院2019年7至12月间，389名疑似肺结核患者的合格痰样，排除标准为治疗超过两周的患者。年龄分布为2～90岁，男性入组280人(72.0%)，女性入组109人(28.0%)。本课题已通过沈阳市第十人民医院伦理委员会批准。

1.1.2主要仪器及试剂 晶芯○R微阵列芯片扫描仪LuxScanTM10K-B，Extractor 36 核酸快速提取仪，HybSet基因微阵列芯片杂交盒，结核分枝杆菌耐药检测试剂盒，北京博奥晶典生物集团有限公司；MGIT960全自动结核分枝杆菌快速培养法仪及配套试剂，美国BD公司；全自动核酸印记微生物检测系统(GT-Blot48)及配套试剂，法国生物梅里埃。

1.2主要方法及工作流程 见图1。

1.2.1痰标本前处理 流程按照《结核病诊断实验室检验规程》[6]规定进行，培养法后剩余痰处理液留作芯片法检测及备用。

1.2.2培养法 按照BACTEC MGIT960系统操作说明书进行操作。仪器报阳后对培养物进行抗酸染色镜检确认，镜下抗酸杆菌扭曲缠绕呈红色绳索状，而其他细菌和细胞呈蓝色。确认为抗酸杆菌后进行MPB64抗原检测，阳性者进入培养法药敏试验(培养管中的药物终浓度为利福平1.0 μg/mL,异烟肼0.1 μg/mL)。

1.2.3芯片法 对于培养阳性标本，取出留存的痰处理液，进行芯片法耐药检测。检测耐药位点包括利福平耐药相关基因rpoB基因检测6个位点，即531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位 CAA→AAA、516位 GAC→GTC、516位 GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG等13种突变型，对于异烟肼耐药相关基因katG基因及inhA基因启动子各检测1个位点，分别为katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2个突变型，inhA基因启动子-15位C→T突变型。按照北京博奥生物集团有限公司的试剂盒说明书进行DNA提取，PCR扩增，芯片杂交及结果判读过程，对于“无法判定”的结果及时进行复检，以确定是否有可用的耐药结果。

1.2.4线性探针耐药检测法 原理基于PCR扩增产物通过反向杂交技术与预先固化在试纸条上的特异性探针杂交，通过条带显色情况判定耐药性。检测耐药基因为rpoB是利福平耐药、katG是异烟肼高水平耐药和inhA是异烟肼低水平耐药，在杂交带上3个基因的野生型和突变型均可以体现。标本处理按照法国生物梅里埃有限公司的试剂盒说明书进行，包括DNA提取、扩增、杂交、制备流程。判读标准为野生条带(利福平8个野生探针，异烟肼katG和inhA野生探针分别为1个和2个)均显色且突变条带无显色时为敏感，野生条带有缺失或突变条带显色为耐药。

图1 主要方法及工作流程图

1.2.5统计学处理 所有检测结果、患者基本信息采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。以MGIT 960药敏试验结果为参考标准，计算芯片法耐药检测的灵敏度、特异度、一致性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和Kappa值以及2种方法对于检测MDR-TB结果的比对，并对结果不一致者进行统计说明。

相关公式解释：灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；一致性=(真阳性例数+真阴性例数)/(真阳性例数+假阳性例数+真阴性例数+假阴性例数)×100%；Kappa值≥0.75两者一致性较好；0.4≤Kappa<0.75两者一致性一般；Kappa<0.4两者一致性较差。

2 结 果

2.1培养法结果 对389例疑似肺结核患者的痰样本进行培养，334例为培养阳性，其中40～60岁年龄段的患者的阳性率最高90.2%(157例)；男性患者阳性检出率88.6%(248例)高于女性78.9%(86例)；初治患者阳性检出率86.9%(232例)高于复治患者为83.6%(102例)，见表1。

2.2药敏结果 334例培阳标本中，2例为MPB64抗原检测阴性，所以有332例进行了MGIT 960药敏试验；同时挑出培阳患者的痰处理液，用芯片法检出共323例有药敏结果，此外检出非结核分枝杆菌2例，这与MPB64的阴性检测结果相符，另有9例无结果(未检出MTB)，这可能是分子法检出限的劣势所致。与参考标准对比，芯片法检测RIF和INH的Kappa值均大于0.75，显示了较好的一致性；芯片法除了异烟肼的灵敏度稍低(82.6%)外，其他方面的参数均较好，见表2。这个结论和大多数文献报道的基本一致。

表1 389例患者特征和培养法对抗酸杆菌阳性的检出情况

表2 芯片法检测利福平和异烟肼耐药与培养法药敏结果的比较

2.3芯片法检测MDR-TB的能力评价 根据治疗史的不同，我们将患者分为初治和复治。与参考标准对比，芯片法检测MDR-TB 的灵敏度、特异度、一致性和Kappa值见表3。在MDR-TB的病人中，应用芯片法检测的Kappa值可以达到0.86，与液体法药敏试验有较好的一致性；并且在初治患者中Kappa值为0.95，灵敏度为95.5%，明显优于复治患者，这对于更早的指导临床参考用药有着非常重要的意义。

表3 芯片法对不同治疗史样本患者MDR-TB结果的判定

2.4不一致的耐药结果 本研究中“不一致”的含义为芯片法对利福平和异烟肼相关耐药基因检测结果与MGIT 960药敏结果不符。总体上看，利福平耐药结果不符者有11例(表4)，其中线性探针法有7例与MGIT 960药敏法一致，4例与芯片法一致；在异烟肼耐药结果的17例(表5)不一致中,线性探针法有9例与参考标准一致，有8例与芯片法一致。

表4 3种检测方法对利福平耐药不一致结果的对比分析

表5 3种检测方法对异烟肼耐药不一致结果的对比分析

3 讨 论

本研究显示，芯片法比培养法药敏试验更快速并且具有较好的准确性[7]，与参考标准比较，对MTB耐药检测及MDR-TB检测的灵敏度、特异度、符合率、PPV、NPV和Kappa值与相关报道的结果相似，即芯片法灵敏度中等，但是特异度较高[8-10]。

分类A中，有5例利福平和14例异烟肼耐药结果为芯片法敏感而MGIT 960药敏法耐药。其原因可能是分子法的检测限一般在20%左右，而表型法的检测限可达到1%[11]；分子法检测的耐药突变位点有限，不能覆盖所有耐药突变的位点；除了位点突变还存在其他耐药机制，如外排泵[12-13]，这也是分子检测不能及的。上述情况也可能是导致芯片法在检测9例培阳痰液时出现未检出MTB的原因。在A分类中，线性探针共有12例与MGIT 960药敏法一致，可能是由于耐药检测范围大于芯片法所致，如芯片法仅检测了rpoB基因核心突变区的6个位点的13种突变类型，而线性探针技术则通过8条分子探针覆盖了rpoB基因核心突变区的全部27个氨基酸的81个碱基[14]；线性探针含有katG315(AGC→ACA)、inhA-16(T→G)、inhA-8(T→C)和inhA-8(T→A)突变类型，而芯片只在katG和inhA基因启动子各测一个位点[15-16]。但是我们是对不一致的样本进行线性探针的检测，所以不能以与参考标准一致结果数量多而断定线性探针法的检测结果更接近于参考标准；其次芯片法的自动判读更大程度的避免的人工判读的误差的产生；此外芯片法的封闭式杂交流程更大程度的避免了非特异片段的干扰和交叉污染的产生，降低了假阳性的出现。

分类B中，有6例利福平和3例异烟肼耐药结果为芯片法耐药而MGIT 960药敏法敏感，这可能的原因是与体外培养可能导致耐药菌亚群比例下降，低于其检测灵敏度有关[17]。也有可能与MGIT360药敏法的利福平终浓度设置过高有关。

总之，实验室污染、多重感染、菌株的低水平耐药、耐药和敏感菌落亚群比例不同或异质性耐药存在都可能导致基因型和表型或是两种分子法结果的不一致，异质性耐药被认为是造成表型与基因型耐药结果不符的重要原因[18]。目前，二代测序技术、分子克隆与数字PCR技术在临床和科研方面也广泛应用，本研究中的结果不一致者(包括疑似异质性耐药)可以通过上述技术在未来的研究中进行进一步的验证。

4 结 论

中国是耐药高负担国家，有效控制和降低MDR-TB总体负担迫在眉睫，而WHO推荐的耐药诊断产品多为进口，存在价格昂贵和战略安全的风险。近年来在我国传染病重大专项的支持下，国内的耐药结核病诊断技术研发取得了显著进展，本研究对国产耐药检测产品的临床应用提供了相关资料的支持。虽然无法取代表型药敏技术，但是芯片法其快速、准确的特点，仍适用于结核病耐药初筛，MDR结核病患者可以通过适当的二线药物快速治疗，取得更好的疗效，考虑到成本、技术专利等问题，国产芯片产品更便于基层临床医院的推广。

利益冲突：无