2013-2018年河南省耐药监测点非结核分枝杆菌流行特征分析

赵东阳，王少华，苏茹月，郑丹薇，朱岩坤，马晓光，石 洁，李 辉，孙定勇

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria bacteria，NTM)是指分枝杆菌属内除结核分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌(M.tuberculosis，MTB)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.mictoti)以及麻风分枝杆菌(M.leprae)等以外的其他分枝杆菌。NTM普遍存在于环境中的土壤和水中，随着社会发展，从城市供水系统和饮用水系统也可分离到NTM[1-2]。NTM是机会致病菌，可以引起肺部或其他器官感染，肺部感染后临床表现与肺结核相似，常被误诊为肺结核病。大部分NTM菌株天然耐药，对一线二线抗结核药物普遍耐药，导致NTM感染后治疗效果不好，并且增加病人的负担[3-4]。本研究中，对河南省耐药监测过程中收集的分枝杆菌阳性培养物进行了NTM分离鉴定及药物敏感试验，以期了解南阳市辖区、中牟县、新密市、嵩县和扶沟县5个监测点的NTM分布情况、流行现状及其耐药性。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2013年1月至2018年12月来自河南省5个耐药监测点结核病定点医院结核病患者痰分枝杆菌培养阳性标本1 811例，其中南阳市辖区493例、新密市406例、中牟县452例、扶沟县225例、嵩县235例，剔除30例信息不完整的病例，共1 781例纳入分析。

1.2NTM初步鉴定和药敏试验 采用传统的对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养法对分枝杆菌阳性培养物进行初筛及鉴定，若该菌在PNB鉴别培养基上能生长，则初步判定为NTM。采用传统固体比例法检测菌株药物敏感性：接种环刮取一环菌株对数生长期培养物，细菌超声分散计数仪(BACspreaderTM1100，体必康)超声分散，用生理盐水配制成1.0麦氏浓度菌液，稀释成10-2和10-4CFU/mL菌液，取0.01 mL各稀释菌液接种于不同含药培养基上，37 ℃培养4～8周观察结果[5]。含药培养基购自河南赛诺特生物技术有限公司，药物浓度分别为PNB 500 μg/mL、TCH 5 μg/mL、异烟肼(INH)0.2 μg/mL、利福平(RFP)40 μg/mL、乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL、链霉素(SM)4 μg/mL、卡那霉素(KM)30 μg/mL、氧氟沙星(OFX)4 μg/mL、卷曲霉素(CPM)40μg/mL、丙硫异烟胺(PTO)40 μg/mL、对氨基水杨酸(PAS)1 μg/mL。

1.3细菌基因组DNA提取 参考张婷等[6]的方法，略作改动：刮取NTM菌落悬于超纯水中，95 ℃金属浴裂解20 min，室温冷却后12 000 r/min离心10 min(4℃)，取上清作为模板。

1.4探针熔解曲线法试验 采用探针熔解曲线法分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(厦门致善)对初筛判定为NTM菌株进行菌种鉴定。该试剂盒可用于临床和环境中常见的19种分枝杆菌的定性鉴定[7]：结核分枝杆菌(复合群)、耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、龟分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、海分枝杆菌或溃疡分枝杆菌、土地分枝杆菌、不产色分枝杆菌、苏加分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌。具体操作参照试剂盒说明书进行。

1.5PCR测序 16S rRNA基因扩增上游引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列：5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′。引物由上海生工生物工程技术有限公司(Sangon)合成。PCR反应体系为50 μL：PCR预混液(2×Mix购自康为世纪公司)25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板5 μL，无菌去离子水16 μL。反应条件：预变性94 ℃ 10 min；然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s共计25个循环；最后72 ℃延伸7 min。同时扩增H37Rv作为对照。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行检测。由Sangon公司测序，并将基因序列提交美国国立生物技术信息中心(national centerfor biotechnology information，NCBI)数据库(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性分析比对。菌株判定及16S rRNA基因系统发育树构建参照文献[8]进行。

1.6统计学分析 使用SPSS19.0软件，采用χ2检验进行比较分析，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1NTM菌株鉴定结果 1 781例分枝杆菌阳性培养物中，67例在PNB和TCH鉴别培养基上均有分枝杆菌生长，初步判定为NTM。67株菌株经探针熔解曲线法和测序鉴定，有2株为结核分枝杆菌。65例NTM中，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)49例(75.4%)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)5例(7.7%)，脓肿分枝杆菌(M.abscessus)3例(4.6%)，鸟分枝杆菌(M.avium)2例(3.1%)，败血症分枝杆菌(M.septicum)(1.5%)，结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌混合感染5例(7.7%)，见表1。NTM菌株16S rRNA的PCR扩增产物长度约900 bp，目的条带单一，具有较好的扩增效果，图1。NTM菌株与从GenBank下载的5株相应标准菌株或代表株的16SrRNA序列构建了系统进化树，菌株均得到良好区分，见图2。

表1 65例NTM临床标本鉴定结果

M为DL2000；1-8为临床菌株；9为阳性对照H37Rv；10为阴性对照

图2 基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树

2.2NTM感染率及变化趋势 2013-2018年分枝杆菌标本中NTM感染率分别为2.0%、3.3%、3.6%、4.4%、5.1%、4.9%，呈逐年上升的趋势(χ2=5.647，P<0.05)，各年之间差异无统计学意义(χ2=6.043，P>0.05)，见图3。南阳市辖区、新密市、中牟县、扶沟县和嵩县5个检测点NTM感染率分别为5.2%、2.7%、4.3%、1.9%、4.5%，见图4，各地之间差异无统计学意义(χ2=6.043，P>0.05)。

图3 2013-2018年NTM感染率

图4 五地区NTM感染率

2.3NTM感染患者性别、年龄和初复治分布 1 781例病人中，男性感染率为3.8%(53/1 388)，女性感染率为3.1%(12/393)，差异无统计学意义(χ2=0.510，P>0.05)。年龄范围16～95岁，50岁以下患者感染率为2.3%(20/840)，50岁以上的患者感染率为4.8%(45/941)，差异有统计学意义(χ2=7.303，P<0.01)。初治病人感染率为2.2%(24/1 097)，复治病人感染率为6.0%(41/684)，差异有统计学意义(χ2=17.359，P<0.01)，见表2。

2.4NTM药敏试验结果 NTM对9种抗结核药物均具有较高的耐药率，见表3。65株NTM中耐多药菌株和广泛耐药菌株分别达到95.4%(62/65)、89.2%(58/65)。

表2 NTM感染患者性别、年龄和初复治分布

表3 65例NTM菌株对抗结核药物耐药率

3 讨 论

已经报道的NTM已经超过190种，新种仍在不断被鉴定发现[9]。本研究经PNB/TCH初筛生长实验鉴别为NTM的67株菌株，经探针熔解曲线法鉴定发现2例为结核分枝杆菌，表明PNB/TCH鉴定存在假阳性，还需要通过分子生物学方法鉴定分离的NTM。探针溶解曲线法[6]能够鉴定常见的NTM，并且可以发现混合感染，操作简单，不足的是对不常见菌株仍要进行测序鉴定。65例NTM感染病例中，胞内分枝杆菌占比75.4%，其它占比24.6%，胞内分枝杆菌是耐药监测地区的优势感染菌株。研究报道甘肃[10]、浙江[11]、云南[12]、沈阳[13]等地的NTM优势感染菌均为胞内分枝杆菌，比例分别为67.92%、52.15%、44.83%、38.9%，低于耐药监测地区。而上海[14]和重庆[15]NTM感染则以堪萨斯结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌为主，占比分别为45.0%和39.54%。这表明不同地区的NTM优势流行菌群不一样，NTM流行菌种和比例差异可能与当地自然气候条件等因素相关。

目前国际上关于NTM感染情况的报道逐渐增多，感染率逐步升高[16-18]。我国历次结核病流行病学抽样调查结果显示，NTM感染率呈上升趋势，2010年进行的第5次全国结核病流行病学调查NTM的感染率达到了22.9%[19-20]。本研究从2013年到2018年河南省5个耐药检测点1 781例患者痰标本分枝杆菌阳性培养物中，鉴定出60例单一NTM感染和5例混合感染，总感染率为3.6%(65/1 781)。NTM总感染率远低于第5次流行病学调查结果的22.9%，也低于杭州地区的21.4%[21]、福建的30.19%[22]；高于沈阳的1.87%[13]、天津的1.84%[23]、湖北的2.21%[24]。NTM的感染率从2.0%上升到5.0%左右，差异无统计学意义。杭州[21]、沈阳[13]的研究结果显示NTM的感染率呈上升趋势，而天津[23]和湖北[24]的研究结果表明NTM感染率无明显增高趋势。5个监测点中南阳市辖区感染率最高为5.2%，扶沟县最低为1.9%，感染率也各不相同。这表明NTM的感染率随着地域变化而变化，部分流行地区比例呈逐步上升趋势。

本研究中1 781例病人中，年龄为50岁以上的患者感染率高于50岁以下人群，云南[12]、杭州[21]等地NTM感染者也是年龄50岁以上占优势。这表明随着年龄增高，免疫水平降低，更容易被感染。本研究中复治病人感染率为6.0%，高于初治病人，与Xu等[25]的报道一致，表明患过结核病的病人更容易受到NTM的感染。

对分离的NTM进行了9种一线、二线抗结核药药物敏感性实验。结果表明，65例NTM对INH的耐药率为100%，对RFP、SM、OFX、CPM、PAS的耐药率超过了80%；耐多药率达到95.4%，广泛耐药率达到89.2%。NTM菌株对抗结核药物表现了普遍耐药性，与以前的报道结果基本一致[10,13,15]。NTM与结核分枝杆菌双重感染表现出与NTM单独感染相似的耐药表型[25]，本研究中5例混合感染药敏结果全为广泛耐药，容易造成病人的误诊误治。因此，临床上遇到NTM感染病例首先需要进行菌种鉴定，然后再进行药物敏感性实验，以确定适当的治疗方案。

本研究尚存在一些不足之处，比如取样点数目少，局限于5个县区，需要扩大纳入范围，才能全面的反映河南省NTM流行情况；由于病人追踪随访困难，研究仅鉴定了NTM感染菌株类型，不能确定患者感染NTM后发病与否，因此这些问题都需要更深入的研究。

综上，河南耐药监测地区近年流行的NTM菌种以胞内分枝杆菌为主。NTM感染者中男性多于女性，复治患者多于初治患者，中老年人易感。NTM临床菌株对常用抗结核药物普遍耐药，临床上需要提高对非结核分枝杆菌病的认识，结合实验室诊断，及时调整病人的治疗方案。

利益冲突：无