青海倒淌河地区羊血清中总钙、磷含量的测试与分析

张正英，张汉青，刘海珍，郝云晴，赵维章，黄文颖，林元清，沈得贵，都占林，李 静，蔡金山

（青海省动物疫病预防控制中心，青海 西宁 810001）

动物体内的钙、磷均靠饲料供给，在体内不能合成，也不能由其他物质转化而来。钙和磷占动物机体总灰分的70 % 以上，动物体总钙量的99 % 以上和总磷量80 %～85 % 存在于骨骼和牙齿中[1]，以维持骨骼和牙齿的正常硬度。其余的钙主要分布在细胞外液（血浆和组织间液）中，动物细胞内钙的含量很少[2]。其余的磷则在细胞外液中和细胞内分布，当血液中钙磷代谢发生紊乱，会促使骨骼脱钙，使血液中钙、磷含量正常或升高，此时检测血液中钙、磷含量正常或升高，但骨骼已处于营养不良状态，导致骨骼的正常结构发生改变，硬度、密度、韧性、负重能力都降低，使骨骼脆弱、变形、肿大，骨骺表面粗糙不平，容易骨折[3-4]。

在当地政府协调下，青海省动物疫控中心组织了24名技术人员对发病区蒙古村、东卫村、黑科村、哈乙亥村等4个村17 282（头只）牛羊发病情况开展了流行病学调查，并对发病羊进行标记，采集血液，先期对可能导致牙齿异常脱落疾病因子含量的排它性实验室检测，因此做好血清钙、磷的检测对疾病的诊断、防范，及治疗有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品 在青海省共和县倒淌河镇地区，结合流行病学调查结果，选择与发病区地理条件相似、未发病地区的临床健康羊30只为对照组A，选择发病区临床症状较轻和症状不明显的羊30只为轻症组B，选择发病区临床症状严重的羊30只为重症组C，采集3个组羊全血样本90份，3 500 r/min离心10 min，取上清液分装，置于-20 ℃ 冰箱保存，进行总钙、磷含量检测。

1.1.2 实验仪器 原子吸收分光光度计PE700（美国珀金埃尔默公司），紫外可见分光光度计752N（北京普析通用），钙元素空心阴极灯，德国超纯水机（德国密尼博纯水机）。

1.1.3 化学试剂 高纯氧化镧，盐酸优级纯，硫酸优级纯，磷酸二氢钾优级纯，三氯醋酸优级纯，钼酸铵分析纯，硫酸亚铁分析纯，钙标准溶液1 000 μg/ml国家标物中心。

1.2 方法

1.2.1 血清中钙的测定 用火焰原子吸收分光光度法。（1）仪器工作条件：波长422.8 nm，灯电流3 mA，狭缝0.7 L，空气流量120 ml/min，乙炔流量120 ml/min。（2）钙标准溶液浓度：钙标准溶 液度 梯度为 0.05 μg/ml，1.0 μg/ml，2.0 μg/ml，3.0 μg/ml，5.0 μg/ml。（3）测定方法：取血清0.1 ml，加无盐氧化镧溶液3.9 ml，混匀，同时做试剂空白对照，将钙标准溶液及样品处理液导入火焰，上机测试，数据统计分析。

1.2.2 血清中磷的测定 用还原钼蓝测定法。（1）测定方法：取血清0.4 ml，缓慢加入0.6 mol/L三氯醋酸溶液7.6 ml，边加边摇，充分混匀，放置10 min，3 000 r/min离心5 min，取上清液，按表1顺序依次加入相应试剂，混匀，放置10 min，用波长620 nm进行比色，空白管调零，读取各管吸光度。（2）结果计算：血清磷浓度（mmol/L）=实测值/标准值×0.129×5。

1.2.3 数据分析 检测结果用Excel表格创建数据库，输入SPSS Statistics 19.0统计软件，运用统计学原理进行数据分析。

表1 磷测定试剂加入顺序表

2 结果与分析

2.1 血清钙含量

对照组血清钙含量范围为 123.28～228.60 mg/kg，平均值为176.10 mg/kg；轻症组99.35～ 192.85 mg/kg，平均值为162.11 mg/kg，重症组含量范围为120.31～230.92 mg/kg，平均值为151.84 mg/kg；统计学分析血清钙含量对照组与重症组差异极显著（P＜0.01）；对照组与轻症组差异显著（P＜0.05）；重症组与轻症组差异不显著（P＞0.05），结果见表2。

表2 血清钙测定结果

2.2 血清钙加标回收结果

每一组检测样品，平行制备6份血清检测溶液，其中3份加入待测元素钙，上机检测，通过计算并求其平均值，回收率分别为对照组99.25 %，轻症组97.34 %，重症组97.88 %。

2.3 血清磷检测结果

对照组血清磷含量范围为0.49～3.64 mmol/L，平均值为 1.64 mmol/L；轻症组 0.94～2.84 mmol/L，平均值为1.85 mmol/L，重症组含量范围为 0.89～3.29 mmol/L，平均值为1.96 mmol/L。统计学分析血清磷含量对照组与重症组差异极显著（P＜0.01）；对照组与轻症组差异显著（P＜0.05）；重症组与轻症组差异不显著（P＞0.05）。

表3 血清磷测定结果

4 讨论

（1）通过本实验测定，从实验数据分析得出血清钙含量对照组与重症组差异极显著（P＜0.01）；对照组与轻症组差异显著（P＜0.05），血清磷含量对照组与重症组差异极显著（P＜0.01）；对照组与轻症组差异显著（P＜0.05）。（2）与发病区地理条件相似，未发病区内健康羊血清钙含量明显高于病区的羊，未发病区内健康羊血清磷含量明显低于发病区的羊。动物体内99 % 的钙和85 % 的磷都沉积在骨骼和牙齿中[5]，饲料中的钙磷主要在小肠被吸收，经血液循环运行到骨骼和全身其他组织以保证骨骼中钙磷的需求平衡，同时骨骼中的钙磷也不断进行分解更新，释放出钙磷进入血液，共同调节血钙、血磷的动态平衡[6]，由于机体钙磷代谢发生紊乱，导致血液中钙含量下降，间接的刺激甲状旁腺激素的分泌，导致骨骼中的钙盐被溶解以维持血钙的正常水平，从而使骨骼发生明显的脱钙[7]，导致骨骼的正常结构发生改变，硬度、密度、韧性、负重能力都降低，使骨骼脆弱、变形、肿大，骨骺表面粗糙不平，容易骨折。（3）血清样品组成非常复杂，对其中无机元素的测定要扣除元素之间的干扰，本研究在测定血清钙时采用无盐氧化镧溶液作为测试介质，有利于测试液形成稳定均一的体系，直接用血清稀释上机测试[8]，避免了消解过程中带来的误差，因此本方法测定简单、快速、安全、准确，取少量血清样品即测试分析，完全能满足实验室检测的需要。（4）还原钼蓝法测定血清磷呈色反应稳定，特异性较高，操作简便，线性范围较广，完全满足实验室检测工作需要。