白杨素通过下调p38-MAPK 磷酸化减轻脓毒症大鼠心肌损伤

郭正亮 俞许超 周 宇 赵敬平 金雪梅 赵 辉

心脏是脓毒症的靶损害器官，其特征是心室扩张，收缩力降低和对液体疗法的心室反应减弱[1]。有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）家族成员p38-MAPK 在心肌抑制中起着至关重要的作用[2]。激活的p38-MAPK 上调细胞因子如白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，其通过促进心肌肥大，刺激收缩功能障碍和诱导心肌细胞导致心力衰竭细胞凋亡[3-4]。白杨素又称白杨黄素，是从紫葳科植物木蝴蝶中提取的一种具有广泛药理活性的黄酮类化合物。研究发现，白杨素对脓毒症有肾脏保护作用，并降低炎症标志物IL-2、IL-4 和IL-6 的水平[5]。本研究拟探讨白杨素减轻脓毒症大鼠心肌损伤的机制，为脓毒症治疗提供理论依据。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级SD 大鼠100 只，8 周龄，体质量（210±10）g，由东南大学实验动物中心提供[动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0013，动物使用许可证号：SYXK（苏）2018-0043，动物质量合格证号：2019031722]；饲养环境：温度22～24℃，湿度50%～60%。本实验由医院动物伦理委员会批准后进行。

1.2 药 物 白杨素（原料药，纯度98%，台州市博纳化工有限公司，批号191027）；地塞米松（原料药，纯度99%，武汉贝尔卡生物医药有限公司，批号50-02-2）；戊巴比妥钠（德国默克公司，批号DM5211）。

1.3 试剂及仪器 RIPA 缓冲液、化学发光检测试剂盒（美国sigma 公司，批号S0914、S1073）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、10%聚丙烯酰胺凝胶电泳膜（碧云天生物技术研究所，批号20181107、20190124）；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司，批号R45685）；逆转录试剂盒（宝日医生物技术北京有限公司，批号RA-1009）；SYBR Prime Script PLUS RT-RNA PCR试剂盒、聚偏氟乙烯膜（宝生物工程大连有限公司，批号B0647、B0826）；蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号PL0037）；抗p38 抗体、抗磷酸化MAPK（p-MAPK）抗体、抗β-actin 抗体、辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗（美国Abcam 公司，批号ab0911、ab1065、ab0723、ab1258）；Vivid 7 Dimension型彩色多普勒超声诊断仪（美国GE 公司）；ZX-987型光学显微镜（日本Olympus 公司）；ABI7500 型实时PCR 检测系统（赛默飞世尔科技中国有限公司）；E-Gel Imager 型凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

2 实验方法

2.1 动物建模及分组 大鼠按随机字母表法分成五组：对照组、模型组、地塞米松组（0.27mg/kg）[6]、白杨素低、高剂量组（20、40mg/kg）[7]，每组20 只。采用盲肠结扎穿孔术（CLP）建立脓毒症模型大鼠：模型组、地塞米松组、白杨素低、高剂量组大鼠用戊巴比妥钠（20mg/kg，腹膜内）麻醉，将腹部刮毛，消毒并切2cm的切口，随后用无菌的3-0 丝线结扎盲肠，用18 号针头刺穿1 次，挤压盲肠以确保一部分粪便回到腹腔，最后，缝合腹腔并消毒[8]。对照组大鼠仅接受剖腹手术。术后6h，地塞米松组、白杨素低、高剂量组给予相应药物灌胃，灌药量1mL/100g，对照组及模型组给予等体积生理盐水，每天1 次，连续给药4 周。

2.2 超声心功能指标测定 各组大鼠给药结束后，应用彩色多普勒超声诊断仪测定左心室舒张末期内径（LVEDD）、短轴缩短分数（FS）、左心室收缩末期内径（LVESD）、射血分数（EF）。

2.3 大鼠心肌组织病理观察 脱颈处死大鼠，获取大鼠心肌组织，将心肌组织固定在10%中性福尔马林缓冲液中，在标准的脱水、二甲苯清除和石蜡包埋操作之后，使用旋转式切片机切割切片（5μm 厚），去石蜡后，使用HE 染色试剂盒对组织切片进行染色。最后，使用光学显微镜观察心肌组织病理学变化。

2.4 大鼠心肌组织p38、p-MAPK mRNA 表达水平测定 Trizol 试剂提取心肌组织总RNA，将总RNA通过逆转录试剂盒合成cDNA，使用SYBR Prime Script PLUS RT-RNA PCR 试剂盒进行实时PCR 分析，所有实验重复3 次。实时荧光定量PCR（qRTPCR）在实时PCR 检测系统进行，引物由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。使用的引物序列如下：p38 正向5'-GTCACTGTGAACGGATTTGGTCTCTTGAGTCGTATT-3'和p38 反向5'-CTGTGACTGAGTCTTCTGGGTGGCAGTGGGTGTGACAT -3'；p -MAPK正向5'-ATGCGAGTTGTTCTCCGTCCTGTGACTGA-3' 和p-MAPK 反向5'-TATCTGCGGTTTCCTCAAGCGGGTGGCAGTGGGTGTGACATCTGTGACTGA -3'；GAPDH 正向5'-CAGGGAAAGCGAGTGGTTGGTAA-3' 和GAPDH 反向5'-TTACCAACCACTCGCTTTCCCTGTG-3'。GAPDH 用作内源对照。反应条件为95℃进行20s，在75℃进行30s，在60℃进行34s（共40 个循环）。总反应体系20μL 包括：正向引物和反向引物各2μL、dH2O 8μL、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ6μL、cDNA 2μL。使用2-ΔΔCt 方法计算p38、p-MAPK mRNA 相对表达水平。

2.5 大鼠心肌组织p38、p-MAPK 蛋白表达水平测定 使用含有新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA 缓冲液中裂解心肌组织蛋白质，采用蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白质浓度，将蛋白质通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏氟乙烯膜上。将膜在5%脱脂奶中封闭，并与抗p38 抗体（1∶1000稀释），抗p-MAPK 抗体（1∶1000 稀释），抗β-actin 抗体（1∶2000 稀释）在4℃下孵育过夜。β-actin 用作内源对照。加入HRP 偶联二抗（1∶1000 稀释）在室温下孵育2h。使用增强的化学发光检测试剂盒对印迹进行显影，并使用凝胶成像系统进行扫描。实验重复3 次。

2.6 统计学方法 应用统计软件SPSS 23.0 进行数据分析，计量数据以均数±标准差（）描述，采用单因素方差分析比较，多重比较采用SNK-q 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 白杨素对脓毒症大鼠心功能指标的影响 与对照组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD 水平升高，FS、EF 水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，地塞米松组、白杨素低、高剂量组LVEDD、LVESD 水平降低，FS、EF 水平升高（P＜0.05）；白杨素高剂量组LVEDD、LVESD、FS、EF 水平较低剂量组改善更明显，与地塞米松组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.2 白杨素对脓毒症大鼠心肌病理结构的改变 对照组心肌结构正常；模型组心肌边界模糊，可见明显炎症细胞浸润及坏死区域；地塞米松组及白杨素高剂量组心肌损伤明显减轻，几乎无炎症细胞浸润，心肌细胞坏死区域明显减少；而白杨素低剂量组仍有明显炎症细胞浸润，心肌细胞坏死区域与模型组比较略微减少。见图1。

3.3 白杨素对脓毒症大鼠心肌p38、p-MAPK mRNA 水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠p38、p-MAPK mRNA 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，地塞米松组、白杨素低、高剂量组p38、p-MAPK mRNA 水平降低（P＜0.05）；白杨素高剂量组p38、p-MAPK mRNA 水平较低剂量组降低更明显（P＜0.05），与地塞米松组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3.4 白杨素对脓毒症大鼠心肌p38、p-MAPK 蛋白水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠p38、p-MAPK 蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，地塞米松组、白杨素低、高剂量组p38、p-MAPK 蛋白水平降低（P＜0.05）；白杨素高剂量组p38、p-MAPK 蛋白水平较低剂量组降低更明显（P＜0.05），与地塞米松组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3、图2。

表1 白杨素对脓毒症大鼠心功能指标的影响（）

表1 白杨素对脓毒症大鼠心功能指标的影响（）

注：对照组给予生理盐水灌胃；模型组给予生理盐水灌胃；地塞米松组给予0.27mg/kg 地塞米松灌胃；白杨素低剂量组给予20mg/kg 白杨素灌胃；白杨素高剂量组给予40mg/kg 白杨素灌胃；LVEDD 为左心室舒张末期内径；LVESD 为左心室收缩末期内径；FS 为短轴缩短分数；EF 为射血分数；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与白杨素低剂量组比较，cP＜0.05

图1 白杨素对脓毒症大鼠心肌病理结构的影响（HE 染色×400）

表2 白杨素对脓毒症大鼠心肌p38、p-MAPK mRNA 水平的影响（）

表2 白杨素对脓毒症大鼠心肌p38、p-MAPK mRNA 水平的影响（）

注：对照组给予生理盐水灌胃；模型组给予生理盐水灌胃；地塞米松组给予0.27mg/kg 地塞米松灌胃；白杨素低剂量组给予20mg/kg 白杨素灌胃；白杨素高剂量组给予40mg/kg 白杨素灌胃；p-MAPK 为磷酸化有丝分裂原激活的蛋白激酶；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与白杨素低剂量组比较，cP＜0.05

4 讨论

白杨素具有多种生物学活性，其抗炎作用已在实验动物模型和临床研究中报道。先前已证明白杨素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、无乳链球菌和多杀巴斯德氏菌具有抑制作用，并且其作用与浓度呈正相关[9]。此外，白杨素可通过抑制p38-MAPK 信号传导途径和TNF-α 的表达来减少急性肺损伤模型大鼠中油酸的产生[7]。通过调节脂多糖（LPS）识别受体的表达，白杨素能够减少内毒素引起的小鼠病理性肺损伤[10]。白杨素在调节免疫反应，减少超敏反应以及抑制体内和体外组胺释放方面具有积极的药理作用[11]。已证明白杨素可通过下调巨噬细胞中Toll 样受体4（TLR4）/核转录因子-κB（NFκB）来抑制LPS 诱导的炎症。白杨素还对LPS 诱发的乳腺炎症反应具有保护作用，其抗炎机制已被证明与NF-κB 和MAPK 信号通路的抑制有关[12]。研究表明，白杨素能够改善心力衰竭大鼠的左心室肥大和功能障碍；阿魏酸钠和白杨素的组合对小鼠的CLP 致死性败血症具有保护作用[7]。本研究结果显示，地塞米松组、白杨素低、高剂量组LVEDD、LVESD 水平低于模型组，FS、EF 水平高于模型组（P＜0.05）。这与上述讨论一致，同时说明，白杨素能提升脓毒症大鼠心功能水平。结合病理学结果，地塞米松组及白杨素高剂量组心肌损伤明显减轻，几乎无炎症细胞浸润，心肌细胞坏死区域明显减少。说明白杨素减轻脓毒症大鼠的心肌损伤可能与白杨素减轻心肌细胞炎症反应有关。

表3 白杨素对脓毒症大鼠心肌p38、p-MAPK 蛋白水平的影响（）

表3 白杨素对脓毒症大鼠心肌p38、p-MAPK 蛋白水平的影响（）

注：对照组给予生理盐水灌胃；模型组给予生理盐水灌胃；地塞米松组给予0.27mg/kg 地塞米松灌胃；白杨素低剂量组给予20mg/kg 白杨素灌胃；白杨素高剂量组给予40mg/kg 白杨素灌胃；p-MAPK 为磷酸化有丝分裂原激活的蛋白激酶；对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与白杨素低剂量组比较，cP＜0.05

图2 白杨素对脓毒症大鼠心肌p38、p-MAPK 蛋白水平的影响

据报道，促炎介质的产生和释放，p38-MAPK 途径的激活在脓毒症诱导的心肌细胞损伤中起重要作用[13]。Janus 激酶/信号转导和转录激活因子，NF-κB 和MAPK 在调节炎症信号转导中很重要。p38 是与免疫和炎症反应相关的重要细胞转录因子，在上述细胞内信号传导途径的融合中具有核心地位[14]。在静止状态下，p38 蛋白与IκB 家族蛋白结合，以无活性形式存在于细胞质中。非活性p38 复合物和活性p38 在细胞质和细胞核之间处于动态平衡[15]。研究表明，对p38 的抑制导致结肠细胞系中IL-6 和IL-8 的生成减少；在炎症性肠病的大鼠模型中，对p38 的抑制可显著降低体内细胞因子mRNA 水平和NF-κB 激活[16]。p38 途径激酶被认为是抗炎药的靶标，这些选择性抑制剂具有良好的药理活性。p38-MAPK 的激活在败血症引起的心肌功能障碍和炎症，以及引起的心肌功能障碍和炎症中起关键作用[17]。本次研究发现，地塞米松组、白杨素低剂量组、白杨素高剂量组p38、p-MAPK mRNA 和蛋白水平低于模型组，且白杨素高剂量组p38、p-MAPK mRNA 和蛋白低于低剂量组。这说明，p38、p-MAPK 磷酸化可导致心肌损伤加重；而白杨素可显著抑制脓毒症大鼠心肌细胞p38-MAPK 磷酸化。

综上所述，白杨素能减轻脓毒症大鼠的心肌损伤，减轻心肌细胞炎症反应；其机制可能与白杨素可显著抑制脓毒症大鼠心肌细胞p38-MAPK 磷酸化有关。