不同氮磷比对斜生栅藻生长的影响

杨小峰 张 静 张沁荣

（1.忻州师范学院 山西忻州 034000；2.忻州市环境保护研究所 山西忻州 034000；3.南京师范大学 江苏南京 210000）

一、研究背景及现状

我国淡水资源严重不足，制约着经济社会的可持续发展，其中水资源时空分布不均是主要原因，另外水资源综合利用率低，浪费和污染严重，特别是随着工业和农业的发展，以及水产养殖业发展，湖泊外源输入性营养盐剧增，农业化肥大量使用，城镇生活污水的直接排放，饲料中营养盐的大量投入，使得水体富营养化问题日益突出，成为威胁湖泊水体和水库水质的主要因素。水体富营养化的危害是多方面的。水体富营养化会使得水生态系统结构和功能严重受损，蓝、绿藻水华频发，破坏水生态系统的稳固性，减少水环境中的生物多样性，破坏生态景观，造成水生动物的大量死亡。严重时，会成为制约发展中国家可持续发展的重要因素，进而引起一系列巨大的经济损失，威胁人类的生存和发展。

水体富营养化的形成原因是复杂的。其中水体中营养盐的富集是引起水华爆发的直接导火索。而氮（N）磷（P）是引起藻类生长的主要生态因子。在我国，湖泊分布跨度较大，南北不同湖泊的水体富营养化程度不同。在南方地区的湖泊水体富营养化程度高，多发生由毒性微囊藻，舟形藻等蓝藻造成的水华现象，在我国北方地区主要是小球藻、栅藻、席藻等绿藻造成。目前，人们对于湖泊水体生长中氮磷元素的影响研究已经取得一定进展。但是水华现象的研究集中于水华频发的南方湖泊，对北方地区水华现象的研究甚少。

斜生栅藻（Scenedesmus obliquus），又称斜生栅列藻，属于绿藻门，绿球藻目，栅藻科，栅藻属，主要分布于我国北方静水水体中，是引起绿藻水华的主要无毒性藻种。斜生栅藻含有虾青素和细胞内含丰富的蛋白质，可作为水生动物饲料；对氮磷有一定的耐受性，可作为评价水质的指示生物；对氮磷元素去除率高，对重金属有良好的吸附性，因此可用于废水处理。自身还具有较高的油脂含量，可作为生物柴油。尤其是在夏季，斜生栅藻是湖泊、水库、池塘、沼泽等静水水体中的优势藻种，其具有易存活、繁殖能力强、环境耐受性强、氮磷利用率高等特点。综上所述：本文通过实地考察与查找相关文献确定将斜生栅藻作为实验藻种。

二、研究目的和意义

在藻类生长过程中，氮、磷为其生长的必要生态因子。氮为藻类蛋白质和叶绿素的主要组成成分之一，而磷元素会直接参与藻类光合作用的各个环节，水体中氮磷的含量会直接影响到藻类生长与叶绿素含量，且叶绿素a可作为藻类生物量的表征，藻密度可作评价水环境富营养的指标。因此，根据文献研究成果以及预实验的方法，设置了五个氮磷比梯度，分别为N:P=4:1、8:1、16:1、20:1、35:1，在实验室条件下对斜生栅藻进行为期两周培养，同时每一浓度设置三个平行实验组，测定不同阶段藻液细胞密度，并测量叶绿素a的含量，分析不同氮磷比对斜生栅藻生长的影响，确定斜生栅藻生长的最适氮磷浓度。为掌握富营养化水体藻类的生长规律，监控淡水水华爆发和指导生态修复富营养化藻华水体提供数据支持。

三、材料与方法

（一）实验材料

1.实验藻种

实验培养藻种为斜生栅藻。

2.主要仪器

AL204电子天平：梅特勒托利多仪器（上海有限公司）；BXM-30R立体压力蒸汽灭菌器：

上海博讯实业有限公司医疗设备厂；RZH-800A智能人工气候箱：杭州汇尔仪器设备有限公司；DK2000igital数码显微镜：麦克奥迪实业集团有限公司；UV2200紫外可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；1850R低速小型台式低温冷冻离心机：恒力离心机械设备有限公司；R300A实验室真空抽滤装置：上海领德仪器有限公司。

3.主要试剂

硝酸钠、焦磷酸钠、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸（EDTANa2）、七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）、蒸馏水、氯化钙CaCl2·2H2O、碳酸钠Na2CO3、硼酸H3BO3、四水氯化锰MnCl·4H2O、硫酸锌ZnSO4、二水合钼酸钠、无水硫酸铜：天津市风船化学试剂科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

4.培养基配制

本实验以未加入氮磷的BG-11培养基为基础，配置为不含氮磷的Stock1、Stock3、Stock4、Stock5。再根据实验氮磷梯度配置不同浓度的Stock2。其中培养基的主要氮源为硝酸钠（NaNO3），主要的磷源为焦磷酸钠（Na4P2O7·10H2O），通过调整Stock2中Na4P2O7·10H2O的取量，从而设置N:P=4:1、8:1、16:1、20:1、35:1五个氮磷比梯度，分别对藻类进行培养，同时每组设置三个平行。

配制过程：

Stock1：称取0.3 g柠檬酸；0.3 g柠檬酸铁铵；0.05 g EDTANa2溶于蒸馏水中，定容至100 mL。

Stock2：称取3 g NaNO3；0.15 g MgSO4·7H2O；Na4P2O7·10H2O（变量）溶于蒸馏水中，定容至100 mL。

Stock3：称取0.19 g CaCl2·2H2O溶于蒸馏水中，定容至100 mL。

Stock4：称取2 g Na2CO3溶于蒸馏水中，定容至100 mL。

Stock5：称取0.286 g H3BO3；0.181 g MnCl·4H2O；0.0222 g ZnSO4；0.0021 g·NaMoO4·2H2O；0.008 g CuSO4·5H2O溶于蒸馏水中，定容至100 mL。具体操作：量取2 mL的Stock1；20 mL的Stock2；2 mL的Stock3；1 mL的Stock4；1 mL的Stock5混合溶于蒸馏水中，定容到1 000 mL。

表1 培养液中磷浓度梯度

（二）实验方法

1.藻的培养

本实验藻类的培养采取批量培养方法。选用15个500 mL锥形瓶，进行清洗、烘干、高压灭菌。将不同氮磷比的300 mL培养液倒入锥形瓶中，每个浓度设置3个平行组，加入3 mL斜生栅藻液，封口膜封口后放入人工气候培养箱中。在温度为25 ℃，光照强度约为50μmol/（m2·s），光暗比为12:12的条件下培养两周。每天充分摇瓶3～4次并依次变换位置。所有操作均在无菌超净台完成。

2.生物量的测定

从接入藻种的第二天起，每隔一日于当天19:00测定生物量。将藻液摇匀后取少量，用血球计数板于光学显微镜下进行观察计数。此过程连续重复七次持续观察。

具体操作：

（1）先用自来水冲洗血球计数板，再用95%乙醇棉球轻轻擦洗后用水冲洗，最后用吸水纸吸干。盖玻片也作同样的清洁处理。

（2）将藻液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴，让藻液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液，然后加盖盖玻片。

（3）静置片刻，待藻液自然沉降与稳定后，可在显微镜下计数。在低倍镜下寻找计数板大方格网，再在大方格网中央寻找计数室并将其移至视眼中央，转用高倍镜观察和计数。

（4）计数区是由25个中方格组成，按对角线方位，数左上a、左下b、右上c、右下d、中央e，5个中方格的藻数。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计统一的规定。菌体位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。

（5）每个样品重复计数2～3次（每次数值不应相差过大，否则重新操作），用Excel统计分析数据并按公式计算出每mL藻悬液所含细胞数量。

（6）测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，自行晾干后，放入盒内保存。

3.叶绿素a 的提取测定

本操作使用丙酮手动研磨浸泡法。以90%丙酮为提取液，使用玻璃纤维滤膜抽滤收集斜生栅藻，避光研磨提取藻中叶绿素，在研磨浸泡后，经过冷冻离心机离心，测定其750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波长下的吸光度值，计算叶绿素a的含量。

三、讨论与结论

（一）讨论

潘非斐，吴楠在研究不同氮磷比对福建沿海米氏凯伦藻生长的影响中得出：海米氏凯伦藻在N:P=32条件下比生长率最快；雷鹏，孙成渤对水华微囊藻进行19天的批量培养得出：微囊藻在N/P=16条件下，生长繁殖情况最好。孙军，刘东艳在研究不同氮磷比率对青岛大扁藻、新月柱鞘藻和米氏凯伦藻生长影响时得出：新月柱鞘藻在N:P=160时细胞比生长速率最快，而青岛大扁藻和米氏凯伦藻分别在4:1和80:1的条件下比生长速率最快[26]。薄香兰，刘兴，窦勇等人在研究不同氮磷比对小球藻叶绿素荧光参数及生长的影响时得出：小球藻在N:P为17.30:1生长最好。

本实验在使用B G-1 1 培养基模拟自然水体培养斜生栅藻时得出:斜生栅藻在批量连续培养14天，在N:P=16的情况下藻类细胞密度最大，为17.53×104个/mL，生物量为40.11 mg/m3。在N:P=32的情况下藻类细胞密度最小。

因此可以通过调节水体中氮磷比来预防或治理斜生栅藻引起的水华。在N:P=4的实验组培养10天后，叶绿素a出现急速下降，可能是由于实验室培养条件使其在达到最大值后，种间竞争激烈出现大量死亡而造成的。其具体原因还有待进一步研究。

（二）结论

氮磷元素为藻类生长的必要元素，氮磷营养盐在水体中的比例也成为水华爆发的关键。在主要由斜生栅藻引发的水体富营养化中，不同氮磷比对藻类生长影响的探究就尤为重要。通过以上实验测定，可以得出：

1.斜生栅藻的生长情况与培养基初始氮磷比有显著的相关性。不同氮磷比下斜生栅藻的生长情况不同。

2.斜生栅藻最适生长N：P为16:1，即当磷含量为505.8 mg氮含量为3 000 mg，在实验室条件下培养12天时，细胞密度可达到最大，为17.53×104个/mL，生物量为40.11 mg/m3。其后依次为N:P=4:1，N:P=8:1，N:P=20:1，N:P=35:1。