17a-羟孕酮试剂盒性能验证及临床评价

姜亚锋，王雷雷，刘双，侯思南，程瑞飞

(1.江苏省连云港市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心,江苏 连云港222000；2.南京中医药大学连云港附属医院检验科，江苏连云港222000）

近年来，随着医疗水平的不断上升，新生儿疾病筛查的覆盖范围逐渐扩大,筛查的疾病种类也在不断的增多[1]。21羟化酶缺乏症(21-hydroxyulase deficiency，简称21-OHD)是最先发现、研究最多的一种先天性肾上腺皮质增生，是最常见的CAH类型。过多的雄性激素均可对患儿生长发育造成一系列的严重影响,女性患儿出现男性化和失盐症状,严重时威胁生命。17a-羟孕酮（17α-Hydroxyprogesterone，简称17-OHP）是目前筛查21-OHD最常用的敏感指标,通过筛查可早期诊断大部分21-OHD类型的CAH患儿。我院新生儿疾病筛查中心为了更好的满足新生儿疾病筛查工作的需要，于2016年购入1235-AUTO DELFIA全自动时间分辨荧光免疫分析仪一台,用于连云港市新生儿疾病筛查项目TSH和17a-羟孕酮的检测。2016年至2018年连云港地区共计筛查新生儿17a-羟孕酮干血斑样本164012例，其中经二代基因测序技术确诊5例，发病率为0.03‰，低于全国范围内的整体发病率1/20000~1/10000[2]。研究表明17a-羟孕酮的检测值受孕周,新生儿出生体重等因素的影响[3-5]，为了提高筛查效率，PerkinElmer厂家推出了B024-104/112新试剂盒，称其效能优于原B015-112试剂盒。根据WS/T420-2013《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证》[6]及CNAS-CL02：2012《医学实验室质量和能力认可准则》[7]及其相关的应用说明文件的要求，本实验室针对B024-104/112试剂盒做精密度、正确度以及线性范围的验证，并验证17a-羟孕酮的筛查切值[8，9]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用B024试剂盒配套的L、H两个浓度样本以及标准品5个浓度样本做试剂盒的性能验证。分别收集2019年1月采用B024-104/112试剂盒筛查样本3269例，2016年至2018年使用B015-112试剂盒筛查样本164012例做百分位数分析。同时收集2018年度B015-112试剂盒筛查并确诊的3例阳性样本，25例初筛阳性样本做两种试剂盒检测结果的比对。所有收集的样本均为新生儿疾病筛查血片采集技术规范[10]要求的合格干血斑。

1.2 仪器与试剂1235-AUTO DELFIA全自动时间分辨荧光免疫分析仪,试剂盒为B024-104/112,标准品由试剂盒自带,质控品由江苏省统一使用的室内质控品（杭州宝荣公司生产，批号R1180101），执行标准：Q/HZBR 1-2016《新生儿筛查血斑质控品》。严格按照B024-104/112试剂盒的使用说明进行样本检测。

1.3 方法

1.3.1 精密度验证实验方法 采用B024-104/112试剂盒自带标准品B、C、E三个浓度样本作为测试样本，每个浓度样本每天测量1个批次，共进行5天，每批次对各浓度样本重复测量3次，每个浓度各15个测量值，采用统计学方法计算批内变异系数CV批内和总变异系数CV总。CV批内和CV总分别小于厂家声称的8.2%、8.3%时为合格。

1.3.2 正确度验证实验方法 采用B024-104/112试剂盒自带质控品L（指定靶值23.3nmol/L,CV%为10%，允许偏移区间16.31～30.29 nmol/L）和质控品H（指定靶值67.9 nmol/L，CV%为10%，允许偏移区间47.53～88.27nmol/L）两个浓度样本作为测试样本，每个样本每天测量1个批次，每批次测量5次，共进行5d，每个浓度各25个测量值，统计测量总均值与靶值的相对偏差是否在允许偏差范围10%内。

1.3.3 线性范围验证实验方法 用B024-104/112试剂盒标准品B、C、D、E、F作为测量样本，每个样本测量3次，在一批测量中完成。以17a-羟孕酮理论值为X轴，实际测量均值为Y轴，进行线性回归分析。

1.3.4 切值的验证及临床评价 对2019年1月连云港市新生儿疾病筛查中心以B024-104/112试剂盒筛查的3269例样本结果进行数据分析，回顾性分析2016年至2018年三年采用B015-112试剂盒检测的164 012例样本,采用SPSS统计软件分别进行百分位数分析并验证切值。同时收集2018年度3个经二代基因测序确诊阳性样本以及25个初筛阳性样本（以B015-112试剂盒检测），采用B024-104/112试剂盒进行检测，与原B015-112试剂盒检测值进行对比验证切值。

2 结果

2.1 精密度验证结果 试剂盒自带标准品B、C、E三个浓度的批内CV%分别为6.72%、3.96%、3.79%，均低于厂家声称的批内变异系数8.2%，批内精密度符合要求。三个浓度总变异系数CV总分别是7.85%、6.88%、6.71%，低于厂家声称的总变异系数8.3%，总精密度符合要求。见表1。

2.2 正确度验证结果 质控浓度L、H靶值分别为23.3nmol/L、67.9nmol/L,各浓度25次测量均值分别为23.9nmol/L、65.57nmol/L,跟靶值的相对偏差分别为2.58%、3.43%，小于允许偏差，符合要求。见表2。

2.3 线性范围验证结果 在5.06～323.67nmol/L的浓度范围内，其线性回归方程为：y=0.9673x-0.2424，R2=0.9999。见图1。

图1 17a-羟孕酮理论值与检测值的线性回归方程

2.4 切值验证结果 通过回顾性分析,B015-112试剂盒的切值为30.0nmol/L取自P99.5，B024-104/112试剂盒P99.5对应的切值为12.4nmol/L,与厂家推荐的12.0nmol/L基本一致,本实验室采用12.0nmol/L作为切值。25例B015-112试剂盒初筛阳性及3例B015-112试剂盒初筛阳性并经二代测序法确诊的样本以B024-104/112试剂盒检测，两种试剂盒检测结果的符合率为92.9%,其中2例B015-112试剂盒初筛阳性，B024-104/112试剂盒检测阴性。以B015-112试剂盒对这2例召回复筛，结果为阴性，临床随诊暂未发现异常，可认为这2例为假阳性，与B024-104/112检测结果相符，这与厂家声明的新试剂盒会降低假阳性率的预期一致。见表3，表4。

表1 17-OHP精密度验证结果(单位：nmol/L)

表2 17-OHP正确度验证结果(单位：nmol/L)

表3 B024-104/112实验方法和B015-112实验方法百分位数结果分布

3 讨论

全国推行的新生儿疾病的大规模筛查,旨在尽早的发现新生儿指标异常并及时有效的进行临床干预，以提高出生人口素质，降低出生缺陷[11-13]。因此全国各地新生儿疾病筛查实验室的技术水平成为重中之重，除了人员资质外，仪器和试剂的性能显得尤为重要,不论是仪器的更替亦或是试剂的变化都要对其性能做出验证及评价，判断其是否满足本实验室的要求。

本文研究结果显示AUTO DELFIA 1235检测17a-羟孕酮的批内变异系数均低于厂家声称的批内变异系数8.2%，批内精密度符合要求。总变异系数均低于厂家声称的总变异系数8.3%,总精密度符合要求。质控浓度L、H的测量总均值均处于允许偏移区间内,与靶值的相对偏差分别为2.58%、3.43%,远小于允许偏差10%，17a-羟孕酮检测的正确度符合要求。在5.06～323.67nmol/L覆盖大部分样本的浓度范围内,标准曲线5个浓度值的检测均值与理论值呈线性关系，相关系数r=0.9999符合要求，线性良好。AUTO DELFIA 1235采用B024-104/112试剂盒检测的精密度、正确度以及线性范围均达到要求，适于临床常规检测使用。

表4 原B015-112和现B024-104/112试剂盒检测值对比

合理的阳性切值对于CAH的筛查是至关重要的，影响筛查结果的判断。由于地区人群分布及筛查实验室的条件的不同,建议建立本实验室合理的切值。在新试剂盒使用初期，如直接使用厂家提供的切值，需要验证切值的合理性。对于17a-羟孕酮的切值的制定国内外实验室多采用百分位数法进行分析，取P99.5或者P99.8相对应的水平来作为该实验室的切值[14,15]。本实验室将试剂盒B015-112和B024-104/112所检测的初筛样本分别进行百分位数法分析，B015-112试剂盒检测数据取其P99.5所对应的值为30.5nmol/L，我实验室将17a-羟孕酮的切值定为30.0nmol/L。为了进一步验证新试剂盒厂家推荐使用的切值12.0nmol/L的可靠性，本实验室采用B015-112试剂盒筛查并经二代测序技术确诊的3例样本以及25个初筛阳性样本,采用B024-104/112试剂盒进行再检测(见表6),符合率为92.9%，2例样本初筛结论不一致，考虑与试剂厂家声称的B024-104/112试剂盒会降低假阳性率有关[16]。12.0nmol/L仅仅作为项目新试剂盒使用初期的本实验室的初始切值，随着大量检测数据和确诊病例的累计,将参考筛查及临床诊断数据来调整切值的设定。此外由于新生儿体内17a-羟孕酮水平与胎龄、出生体重，是否早产等因素有关[17-19]，也与新生儿合并心肺疾病有关[20]，只设定一个总的切值存在一定局限性。后期将积累更多的初筛样本，结合胎龄，出生体重等各种影响因素，做进一步的大数据分析,以建立更加符合本实验室的17a-羟孕酮的切值,以在减少假阳性率的同时防止CAH的漏诊。