血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ的变化与肺结核肺部受累情况及化疗预后的关系

曾俊风，徐瑞峰，朱喜增，卢瑞杰，孙春伟，霍丽亚，张红谨

（1.南阳市中心医院感染肝病科，河南 南阳473000；2.南阳市中心医院内分泌科，河南 南阳473000）

肺结核是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的传染病,其发病与机体免疫系统有一定关联[1]。MTB感染后，肉芽肿、干酪样坏死、空洞等症状时有发生，导致这些病变的机制仍不完全清楚，有研究显示[2,3]，机体受到MTB侵袭后,免疫系统被激活，一些急性反应蛋白水平增高，基质蛋白酶抑制剂-1(Matrix protease inhibitor,TIM P-1)、蛋白水解酶如(Proline Peptidase,PEPD)水平也可反映结核病患者病理的改变。Th1/Th2细胞应答在结核免疫调控中发挥重要作用,肺被结核杆菌感染后使T淋巴细胞和巨噬细胞被激活,巨噬细胞活化期间,体内将产生大量的炎性递质和细胞因子[4]。γ-干扰素(interferon-γ,INF-γ)作为Th1型细胞因子,在机体的抗结核免疫反应中发挥一定作用。负性协同刺激分子T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin mucin molecule 3,Tim-3),抑制T细胞的活化和增殖,是一种导致T细胞功能耗竭的标志性分子,全长的膜型Tim-3(flTim-3)是Tim-3常见的形式[5,6]。大多研究常集中于flTim-3,而对可溶性T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Soluble T cell immunoglobulin mucin molecule-3,sTim-3）的报道很少,肺结核病感染过程中sTim-3与Th1/Th2之间的关系不清楚。选取我院传染病科确诊的初治肺结核患者健康体检对象作为研究对象,并根据患者影像学资料分为单肺受累组/双肺受累组，检测患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平并与健康者进行比较，揭示其与发病、肺部受累病情及治疗结果判断的相关性,阐明其对肺结核的辅助诊断、肺部受累病情及治疗结果判断的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取我院2015年1月-2017年12月确诊的98例初治肺结核患者为病例组、90例健康体检对象为对照组。病例组，年龄27~75岁，平均57.5±12.6岁，男48例、女50例；其中痰涂片阳性57例；其中单肺受累41例、双肺受累57例；所有患者均按照《肺结核诊断和治疗指南》中的标准进行规范性治疗，其中60例为治愈病例（治愈人群和临床治愈人群）、38例为治疗失败病例（患者经过6个月的治疗，患者影像学、痰液细菌学检查阳性，需要进一步延长治疗）。对照组，年龄23~75岁,平均55.9±11.0岁,男46例、女44例；两组患者的年龄、性别、比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。入选标准：⑴肺结核的诊断及治疗标准参考《肺结核诊断和治疗指南》；⑵肺结核患者的临床疗效评价标准参考《中国结核病防治规划实施工作指南》中患者转归分类标准；⑶所有纳入结核病患者经过痰培养、痰涂片阳性或根据影像学检查显示与活动性肺结核病相似的临床症状(咳嗽、咳痰、咯血等)；⑷本研究符合《赫尔透辛基宣言》相关医学伦理规定，经我院医学伦理委员会批准。排除标准：⑴全身感染性疾病；⑵伴有肺部或其他部位的原发性肿瘤；⑶自身免疫性疾病；⑷长期使用免疫抑制剂、糖皮质激素类药物的患者；⑸既往治疗失败的肺结核患者。

1.2 血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ检测方法治疗前分别采集结核患者及健康体检者血样4ml，37℃下促凝0.5h、按要求离心后，取上清置于EP管中置于-80℃冰箱中待测。

ELISA法检测TIMP-1、PEPD、sTim-3的含量[16,17]。将标准蛋白TIMP-1、PEPD、sTim-3分别按照说明书稀释操作，遵照ELISA试剂盒（购自上海鑫乐生物科技有限公司）说明书步骤进行操作。最后使用xMark酶标仪(购自Bio-Rad公司)测量在450 nm波长下的吸光度值，随后以标准品浓度值为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，将待测样本的吸光度值代入,求得血清中TIMP-1、PEPD、sTim-3的浓度。

用CBA法测定血清中IFN-γ水平，严格按照试剂盒（购自BD公司）说明书稀释标准品，用流式细胞术分析,根据标准曲线计算样品中IFN-γ浓度。

1.3 治疗方案 给予左氧氟沙星（第一三共制药（北京）有限公司）静脉滴注，每次0.2～0.3g，2次/d。口服利福平胶囊（沈阳红旗制药有限公司生产；国药准字H21021905）0.45g，1次/d。盐酸乙胺丁醇片（沈阳红旗制药有限公司生产；国药准字H210 22349）0.75g，1次/d；异烟肼片（宜昌人福药业有限责任公司生产；国药准字H42022005）0.3 g，1次/d；治疗6个月。治疗后记录治疗结果，分别检测TIMP-1、PEPD、sTim-3、IFN-γ浓度。

1.4 统计学方法 本研究所有数据均采用SPSS21.0进行统计学处理，血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平采用±s表示，组间对比应用t检验；计数资料对比应用χ2检验；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组和对照组的血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比较 病例组患者的血清PEPD、sTim3水平显著高于对照组（P＜0.05），病例组患者的血清IFN-γ水平显著低于对照组（P＜0.05）,病例组和对照组的血清TIMP水平组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；见表1。

表1 病例组和对照组的血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比较（±s）

表1 病例组和对照组的血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比较（±s）

组别n PEPD（mU/ml）sTim3（ng/ml）病例组对照组t值P值98 90 TIMP-1（ng/ml）20178.4±4428.1 18910.2±4817.3 1.881 0.062 1288.5±320.1 844.1±155.8 11.935 0.000 14.66±3.20 6.73±1.84 20.588 0.000 IFN-γ（pg/ml）2.70±0.81 4.83±0.90-17.079 0.000

2.2 不同肺部受累情况的肺结核患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比较 双肺受累的肺结核患者的血清TIMP-1、PEPD、sTim3水平显著高于单肺受累组（P＜0.05），双肺受累的肺结核患者血清IFN-γ水平显著低于单肺受累组（P＜0.05）；见表2。

表2 不同肺部受累情况的肺结核患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比较（±s）

表2 不同肺部受累情况的肺结核患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比较（±s）

肺部受累情况单肺双肺t值P值n PEPD（mU/ml）sTim3（ng/ml）41 57 TIMP-1（ng/ml）19301.2±3302.1 21061.8±4175.6-2.241 0.027 1017.4±264.0 1512.6±285.1-8.746 0.000 11.85±3.11 17.20±2.94-8.674 0.000 IFN-γ（pg/ml）3.20±0.68 2.26±0.77 6.255 0.000

2.3 不同治疗转归结局患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比较 治疗6个月后，治愈组的血清TIMP-1、PEPD、sTim3水平显著低于治疗失败组（P＜0.05），治愈组的血清IFN-γ水平显著高于治疗失败组（P＜0.05）；见表3。

表3 不同治疗转归结局患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比较（±s）

表3 不同治疗转归结局患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比较（±s）

治疗转归治愈组失败组t值P值n PEPD（mU/ml）sTim3（ng/ml）60 38 TIMP-1（ng/ml）19076.2±3212.6 20466.0±3521.8-2.010 0.047 940.1±228.7 1172.5±330.4-4.115 0.000 8.40±2.85 12.85±2.17-8.227 0.000 IFN-γ（pg/ml）3.92±0.95 3.11±0.67 4.580 0.000

3 讨论

肺结核病是与机体免疫相关的感染性疾病，MTB感染后,肉芽肿、干酪样坏死、空洞等症状时有发生。MBT感染后CD4+淋巴细胞释放的各种细胞因子的免疫反应可对机体产生保护作用，CD4+淋巴细胞主要分成两种亚型，即Th1、Th2[7]。

其中INF-γ主要是由Th1细胞释放,能诱导细胞免疫,增强人体组织抗原II分子在效应相关巨噬细胞表面的表达，使Th1细胞的免疫反应增强，杀死病原微生物的效应显著[8]。研究结果显示，与对照组相比，肺结核患者血清中INF-γ水平较低，推测MTB感染阶段可能存在以IFN-γ失衡，Th1细胞型免疫反应受到抑制，抵抗肺结核的作用减弱。sTim3是负性共刺激分子，与其相应配体结合后能抑制T淋巴细胞增殖,对免疫应答起着负调控的作用[9,10]。结果显示，肺结核患者血清中sTim-3水平较对照组高,而IFN-γ水平较低，提示sTim-3可能参与T细胞介导的MTB感染期间Th1细胞型免疫应答的负调控。肺结核组sTim-3水平高于对照组，双肺损害组也较单肺损害组高，提示sTim-3可能同样影响机体CD4+T细胞的功能，参与肺结核患者体内Th1细胞/Th2细胞免疫失衡,从而使机体杀伤MTB的能力减弱,进一步促进肺结核的发展。

已有研究[11]发现肺结核患者基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）增高，MMP-9在有肉芽肿的患者中较无肉芽肿患者高，MMP-9水解并整合基质中各种胶原酶和蛋白酶，而TIMP-1可以抑制MMP-9的活性,使其水解各种酶的作用减弱。本研究发现双肺损害组TIMP-1水平高于单肺损害组，治疗前TIMP-1水平也较治疗后高,可能是由于双肺损害组产生的肉芽肿组织干酪样坏死和液化情况较严重，PEPD是蛋白水解酶的一种，可以水解肽段羧基端的脯氨酸或羟脯氨酸，可调节MTB细胞质外应激反应。在实验中，结核病组的PEPD水平高于健康对照组，这可能是由于免疫球蛋白增加和结核病患者肉芽肿发病率导致的。双肺损伤严重程度高于单肺损伤组。因此，PEPD增加更多。

给予患者治疗六个月后,治愈组的血清TIMP-1、PEPD、sTim3水平显著低于治疗失败组，治愈组的血清IFN-γ水平显著高于治疗失败组。乙胺丁醇、异烟肼和利福平是临床常用的抗结核药，疗效较好，缺点是毒副作用大，抑菌效果不好，患者较易产生耐药性[12]。左氧氟沙星第3代的抗菌药物，抑菌效果显著,作用于人体后可明显抑制细菌脱氧核糖核酸旋转酶的合成,清除肺部存有的结核分枝杆菌，阻止对肺部造成伤害；而且左氧氟沙星与血浆蛋白的亲和力不足，两者结合较困难，所有该药物能更好地渗透细胞内，减少药物的消耗，杀菌效果很可观[13,14]。

尉理梁[15]等的研究显示，肺结核病患者血清蛋白与肺结核病发病、病理改变存在关联,血清TIMP-1、PEPD水平可以反应肺结核病的严重程度。我院不仅对上述两种指标进行了检测,还对肺结核患者免疫细胞因子水平进行了研究,使论据更加全面，但本研究也有不足的地方，由于研究时间的限制，病例数较少、缺乏较长时间随访及观察，对患者治疗后一定时间的情况缺乏了解,忽视了用药后药物可能产生的副作用。在接下来的研究中，需要更大样本和长时间随访的支持,进一步验证所采用指标的临床价值。

综上所述,检测血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平对于肺结核的辅助诊断、肺部受累病情及治疗结果判断均具有一定的参考意义。