α-平滑肌肌动蛋白、上皮钙黏素在腹膜透析大鼠腹膜组织中的表达及意义

终末期肾脏病（End-stage renal disease，ESRD）是各种慢性肾脏疾病的终末阶段，可引起尿毒症的各种症状，临床只能采用肾脏替代疗法治疗。腹膜透析是目前ESRD病人常用的替代治疗方法之一，具有良好的治疗效果。随着腹膜透析的长期进行，腹膜透析病人易并发腹膜纤维化（Peritoneal fibrosis，PF），引起腹膜结构和功能的改变，出现超滤衰竭，导致腹膜透析治疗失败。分析腹膜透析病人发生PF的机制，寻找特异性的分子标志物，对于临床治疗具有重要意义。α-平滑肌肌动蛋白（asmooth muscle actin，α-SMA）是成纤维细胞转化成肌成纤维细胞的标志，参与肺脏、肝脏、肾脏等多组织的纤维化。上皮钙黏素（E-cadherin）是一类钙依赖性跨膜糖蛋白，对维持细胞形态及细胞间的粘附具有重要作用。已有研究显示，α-SMA和E-cadherin在腹膜纤维化大鼠中出现差异表达，但其在腹膜透析大鼠中的表达及其与腹膜组织病变之间的关系尚不清楚。因此，本课题组于2018年10月至2019年3月建立了腹膜透析大鼠模型，探讨α-SMA和E-cadherin在腹膜透析大鼠中的表达及意义，旨在为临床ESRD的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与动物

光学显微镜（BX50）购自日本Olympus公司；4.25%腹膜透析液购自上海长征富民金山制药有限公司，国药准字H31020945；SP免疫组化试剂盒购自上海经科化学科技有限公司；RT-PCR试剂盒、引物均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；小鼠抗α-SMA抗体和E-cadherin抗体、生物素标记羊抗兔IgG购自武汉华美生物工程有限公司。

SPF级SD大鼠雄性45只，周龄范围为12～15周，体质量范围为180～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2017-0001，饲养于河南科技大学第一附属医院动物中心实验室，保持室温恒定为25℃，模拟昼夜，自由摄食与饮水。

1.2 动物造模及给药

抽签选取26只大鼠预饲养7 d后，采用5/6肾切除法制备大鼠尿毒症模型，腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，常规消毒皮肤，取侧卧位，逐层切开皮肤以及肌肉，游离肾脏，剥除肾包膜，切除左肾的上下极约全肾的2/3，电凝刀电凝止血，术后一周行右侧切口，进行右肾全切，术后第5周，采集大鼠尾静脉血液，采用生化分析仪测定肾功能，若肾功能异常则造模成功。26只大鼠死亡5只，21只造模成功，抽签选取造模成功的20只大鼠将其分为模型组和腹膜透析组。剩余的19只大鼠抽签选取10只大鼠为假手术组，仅切开皮肤，游离肾脏，剥除左、右肾包膜，不进行切除。术后第5周行腹透植管术，在下腹中线右侧0.2 cm处植入自制腹透管，植管2周以后假手术组和模型组每日腹腔灌注生理盐水20 mL，腹膜透析组每日腹腔灌注4.25%腹膜透析液20 mL，共持续6周。

1.3 腹膜平衡试验

大鼠停止透析24 h后行腹膜平衡试验，通过腹透导管腹腔灌注20 mL 4.25%腹膜透析液，90 min后处死大鼠，采用注射器收集大鼠腹腔内液体，计算腹膜超滤量，并测定透出液肌酐（D-Scr）、血肌酐（P-Scr）、初始腹透液葡萄糖（D0）及透出液中葡萄糖（D1）的浓度，计算D/P-Scr和D1/D0值。

1.4 腹膜组织病理学检查

无菌条件下，取大鼠腹部壁层腹膜组织，用4%多聚甲醛溶液固定24 h后，进行常规的脱水、透明、浸蜡及包埋，切片（约4µm厚），一份进行苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察腹膜组织的病理学变化；一份切片采用Masson染色，测量腹膜厚度，每张切片盲法随机测量12个高倍镜视野，平均值作为腹膜组织厚度。

1.5 RT

-

PCR测定腹膜组织α

-

SMA和E

-

cadherin mRNA的表达

取大鼠腹部壁层腹膜组织约50 mg，匀浆，用Trizol法提取组织的总mRNA，采用紫外分光光度计确定其浓度，经反转录试剂盒合成互补DNA（cDNA），进行RT-PCR反应，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，α-SMA正向引物：5"-TTACGAGTTGCCTGATGG-3"，反向引物：5"-TGCTGTTGTAGGTGGTTTC-3"，E-cadherin正向引物：5"-AGTGAACAACGATGGCATTT-3"，反向引物：5"-CTCAGCCCGAGTGGAAAT-3"，反应体系参考已有文献报道。

1.6 免疫组化检测腹膜组织种

α-

SMA和E

-

cadherin蛋白的表达

另一份切片进行免疫组化检测，将切片置于65℃烤箱脱蜡水化2 h，依次经二甲苯透明，梯度乙醇脱水，加入EDTA（乙二胺四乙酸）缓冲液修复抗原10 min，加入3%过氧化氢孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶，加入BSA（牛血清白蛋白）封闭20 min，加入50µL一抗（1∶200），4℃下孵育过夜，加入50µL生物素标记的二抗（1∶500）孵育1 h，加入DAB（二氨基联苯胺）显色，苏木素复染，氨水返蓝，中性树胶封片，显微镜下观察蛋白表达，随机选取5个视野，测定其平均光密度值。

2 结果

2.1 腹膜组织的超滤量和转运能力

与假手术组相比，模型组和腹膜透析组大鼠的腹膜超滤量和D1/D0明显下降（

P

＜0.05），D/P-Scr明显升高（

P

＜0.05）；模型组相比，腹膜透析组大鼠的腹膜超滤量和D1/D0明显下降（

P

＜0.05），D/P-Scr明显升高（

P

＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠腹膜组织的超滤量和转运能力/±s

2.2 腹膜组织的病理组织学变化

HE染色显示，假手术组大鼠腹膜组织有一层连续的扁平间皮细胞覆盖，细胞排列完整有序；模型组大鼠腹膜组织有部分间皮细胞层脱落，炎症细胞增多；腹膜透析组大鼠腹膜表面有部分甚至全部间皮细胞层脱落，炎症细胞明显增多；Masson染色显示，假手术组大鼠腹膜组织薄且完整；模型组大鼠腹膜组织厚度增加；腹膜透析组大鼠腹膜厚度增加，基质增厚明显，可见纤维细胞增生，见图1。与假手术组（12.14±1.53）µm相比，模型组（20.51±2.72）µm和腹膜透析组（36.74±4.83）µm大鼠的腹膜厚度明显增加（

P

＜0.05）；模型组相比，腹膜透析组大鼠的腹膜厚度明显增加（

P

＜0.05），

F

=141.923，

P

＜0.001。

2.3 腹膜组织中α

-

SMA和E

-

cadherin的mRNA水平

与假手术组相比，模型组和腹膜透析组大鼠α-SMA的mRNA水平明显上调（

P

＜0.05），E-cadherin的mRNA水平明显下调（

P

＜0.05）；模型组相比，腹膜透析组大鼠α-SMA的mRNA水平明显上调，E-cadherin的mRNA水平明显下调（

P

＜0.05），各组大鼠α-SMA和E-cadherin的mRNA水平呈负相关关系（

P

＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠腹膜组织中α-SMA和E-cadherin的mRNA水平比较/±s

2.4 腹膜组织中α

-

SMA和E

-

cadherin蛋白的表达

与假手术组相比，模型组和腹膜透析组大鼠α-SMA的蛋白表达明显上调，E-cadherin的蛋白表达明显下调，差异有统计学意义（

P

＜0.05）；模型组相比，腹膜透析组大鼠α-SMA的蛋白表达明显上调，E-cadherin的蛋白表达明显下调，均差异有统计学意义（

P

＜0.05），各组大鼠α-SMA和E-cadherin的蛋白表达呈负相关关系，差异有统计学意义（

P

＜0.05），见图2、表3。

表3 各组大鼠腹膜组织中α-SMA和E-cadherin蛋白的表达比较/±s

2.5α

-

SMA和E

-

cadherin的mRNA水平与腹膜结构和功能之间的相关性

大鼠腹膜组织中α-SMA的mRNA水平与腹膜厚度和D/P-Scr呈正相关关系（

P

＜0.05），与腹膜超滤量和D1/D0呈负相关关系（

P

＜0.05）；E-cadherin的mRNA水平与腹膜厚度和D/PScr呈负相关关系（

P

＜0.05），与腹膜超滤量和D1/D0呈正相关关系（

P

＜0.05），见表4。

表4 α-SMA和E-cadherin的mRNA水平与腹膜结构和功能之间的Pearson相关性分析

3 讨论

腹膜透析是ESRD病人最主要的治疗手段之一，利用腹膜作为半渗透膜，通过注入腹腔的腹膜透析液与腹膜血管中的血液进行水分和溶质的交换，清除机体的代谢产物和毒性物质，纠正电解质和酸碱平衡。临床研究显示，随着腹膜透析时间的延长，长期腹膜透析病人可出现腹膜结构和功能的改变，出现PF，导致临床治疗失败。分析腹膜透析病人并发PF的机制，对于临床治疗具有重要意义。因此，本研究建立了大鼠尿毒症模型和腹膜透析模型，模拟临床腹膜透析ESRD病人，来分析腹膜透析病人并发PF的机制。本研究中，模型组大鼠的腹膜超滤量、D1/D0明显下降，D/P-Scr明显升高，可能是由于尿毒症大鼠体内代谢废物、毒性物质的蓄积，引起水、电解质平衡紊乱，在一定程度上影响了腹膜的功能。本研究中，相比于模型组大鼠，腹膜透析大鼠的腹膜超滤量、D1/D0明显下降，D/P-Scr明显升高。腹膜超滤量是透出身体内毒素及小分子，D1/D0和D/P-Scr主要反映了腹膜转运小分子溶质的能力，提示腹膜透析大鼠腹膜组织清除小分子的能力下降。吴炜飞等的研究显示，腹膜转运能力是评价ESRD病人腹膜透析治疗后死亡率的关键因子，腹膜形态结构和功能的改变，引起小分子溶质转运的增加，腹膜超滤量的减少，最终引起超滤衰竭，迫使ESRD病人退出腹膜透析治疗，提示腹膜透析大鼠在长期接受腹膜透析治疗的过程中，可能发生了腹膜组织结构和功能的改变，引起腹膜超滤量下降，转运能力下降。

腹膜主要由腹膜间皮细胞层和间皮下的间皮组织构成，腹膜间皮细胞结构和功能的完整性是保证腹膜功能的重要因素。本研究中，腹膜透析大鼠的腹膜厚度增加，可见纤维细胞增生，提示腹膜透析大鼠发生了PF，引起了腹膜间皮细胞结构和功能的改变。本研究中，腹膜透析大鼠的α-SMA的表达明显上调，E-cadherin的表达明显下调。α-SMA是成纤维细胞转化成肌成纤维细胞的标志，活化的成纤维细胞可以分泌大量的α-SMA，促进细胞外基质的分泌和沉积，可以促进PF的发生。E-cadherin是一种钙依赖性的跨膜糖蛋白，对维持细胞形态和调节细胞粘附具有重要作用。临床研究显示，E-Cadherin蛋白表达下调，可以导致细胞间黏附作用下降，出现肌成纤维细胞的表型，促进成纤维细胞分泌大量的α-SMA，最终导致PF发生，提示腹膜透析大鼠的腹膜间皮细胞在长期接受腹膜透析的过程中，E-Cadherin蛋白表达下调，发生了表型转变，呈现为肌成纤维细胞，使得α-SMA表达上调，促进PF的发生。本研究中，α-SMA和E-Cadherin的表达呈负相关关系，提示E-Cadherin表达下调可能通过促进腹膜间皮细胞向肌成纤维的表型转变，促进α-SMA的分泌增加。本研究中，α-SMA和E-Cadherin的表达与腹膜厚度、腹膜超虑量、D1/D0和D/P-Scr具有相关性，提示α-SMA和E-Cadherin的表达与腹膜的功能密切相关，进一步证实α-SMA和E-Cadherin参与了PF的发生发展。

综上所述，腹膜透析大鼠的α-SMA的表达明显上调，E-Cadherin的表达明显下调，α-SMA和E-Cadherin的表达与腹膜厚度、腹膜超虑量、D1/D0和D/PScr具有相关性，有望应用于临床腹膜透析病人的治疗。但腹膜透析病人腹膜组织中α-SMA和E-Cadherin的表达是否与腹膜透析大鼠一致尚不清楚，有待于进一步的临床研究。