CAP2在结肠癌组织及癌旁组织中的表达及临床价值

钟爱芳 肖慧

【摘要】 目的：探討腺苷酸环化酶相关蛋白2（CAP2）在结肠癌组织及癌旁组织中的表达及临床价值。方法：回顾性分析2018年10月-2020年10月本院收治的50例结肠癌患者的临床资料。取患者结肠癌组织及癌旁组织，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法测定组织CAP2 mRNA表达，采用免疫组化法测定组织CAP2蛋白表达，并测定术前血清癌胚抗原（CEA）、CA19-9水平。分析CAP2蛋白表达与临床病理特征相关性;采用Kendall相关分析CAP2蛋白与CEA、CA19-9的相关性;采用受试者工作特征（ROC）曲线评估CAP2对结肠癌的诊断价值。结果：结肠癌组织CAP2 mRNA表达水平明显高于癌旁组织（P<0.05）。结肠癌组织CAP2蛋白阳性表达率为70.00%，明显高于癌旁组织的16.00%（P<0.05）。不同分化程度、浸润程度、TNM分期、淋巴结转移、术前CEA及CA19-9水平的结肠癌组织CAP2蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。Kendall相关分析显示，结肠癌组织中CAP2蛋白阳性表达率与术前血清CEA、CA19-9均呈正相关（τ=0.467、0.544，P<0.001）。ROC曲线显示，CAP2 mRNA、CAP2蛋白对结肠癌具有一定诊断价值（AUC=0.895、0.770，P<0.001）。结论：结肠癌组织CAP2表达水平明显高于癌旁组织，且其高表达与患者分化程度、浸润程度、TNM分期、淋巴结转移、术前CEA及CA19-9水平密切相关，提示CAP2参与了结肠癌发生、进展，可能成为治疗结肠癌潜在靶点。

【关键词】 腺苷酸环化酶相关蛋白2 结肠癌 CEA CA19-9

[Abstract] Objective： To investigate the expression and clinical value of adenylate cyclase related protein 2 （CAP2） in colon cancer tissue and adjacent tissue. Method： The clinical data of 50 patients with colon cancer admitted to our hospital from October 2018 to October 2020 were retrospectively analyzed. The colon cancer tissues and adjacent tissues were taken， real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） was used to determine the expression of CAP2 mRNA in tissues， and CAP2 protein in tissues by immunohistochemistry. Serum carcinoembryonic antigen （CEA） and CA19-9 levels were measured before operation. The correlation between CAP2 protein expression and clinicopathologic features was analyzed. Kendall correlation was used to analyze the correlation between CAP2 protein and CEA， CA19-9. The diagnostic value of CAP2 in colon cancer was evaluated by receiver operating characteristic （ROC） curve. Result： The expression level of CAP2 mRNA in colon cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues （P<0.05）. The positive expression rate of CAP2 protein in colon cancer tissues was 70.00%， which was significantly higher than 16.00% in adjacent tissues （P<0.05）. There were statistically significant differences in the positive expression rate of CAP2 protein in colon cancer tissues with different degrees of differentiation， degree of invasion， TNM stage， lymph node metastasis， preoperative CEA and CA19-9 level （P<0.05）. Kendall correlation analysis showed that the positive expression rate of CAP2 protein in colon cancer tissue was positively correlated with serum CEA and CA19-9 before operation （τ=0.467， 0.544， P<0.001）. ROC curve showed that CAP2 mRNA and CAP2 protein had certain diagnostic value in colon cancer （AUC=0.895， 0.770， P<0.001）. Conclusion： The expression level of CAP2 in colon cancer tissues is significantly higher than that in adjacent tissues， and its high expression is closely related to the degree of differentiation， degree of invasion， TNM stage， lymph node metastasis， preoperative CEA and CA19-9 levels， suggesting that CAP2 is involved in the occurrence and progression of colon cancer， and may become a potential target for the treatment of colon cancer.

[Key words] Adenylyl cyclase related protein 2 Colon cancer CEA CA19-9

First-author’s address： Xingguo County People’s Hospital， Xingguo 342400， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.25.002

结肠癌（colon cancer）为一类常见消化道恶性肿瘤，早期患者无明显症状，大部分患者确诊时已进展至中晚期，预后较差[1]。因此，寻找有效诊断结肠癌标志物对防治结肠癌意义重大[2]。腺苷酸环化酶相关蛋白2（adenylyl cyclase related protein 2，CAP2）主要分布于人心脏、骨骼组织中，是一类高度保守蛋白质[3]。研究表明，CAP2在胶质瘤、乳腺癌、肝癌等恶性肿瘤中呈高表达，且和患者预后有关[4]。目前，CAP2在结肠癌组织表达以及对结肠癌诊断价值相关报道较少。为此，本研究回顾性分析2018年10月-2020年10月本院收治的50例结肠癌患者的临床资料，测定其癌组织与癌旁组织CAP2 mRNA及蛋白表达，探讨CAP2蛋白表达和结肠癌患者临床病理特征关系及对结肠癌诊断价值，以期为防治结肠癌提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2018年10月-2020年10月本院收治的50例结肠癌患者的临床资料。纳入标准：术后病理检查确诊;术前未行其他治疗;临床资料完整。排除标准：术中死亡患者;合并肝、肾功能异常;合并其他恶性肿瘤;合并严重感染性疾病;合并COPD或其他已知可能对CAP2表达产生影响疾病。50例患者中男32例，女18例;年龄45～82岁，平均（64.51±18.56）岁;肿瘤直径平均（5.02±1.29）cm;分化程度：15例低分化，26例中分化，9例高分化;浸润程度：T1、T2期13例，T3、T4期37例;TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期17例，Ⅲ，Ⅳ期33例，其中淋巴结转移20例。

1.2 方法

1.2.1 临床病理特征收集 通过查看患者住院期间电子病历收集性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、浸润程度、TNM分期、淋巴结转移、术前CEA、CA19-9水平等临床病理特征。

1.2.2 标本来源 50例患者均行结肠癌根治术，术前1 d清晨抽取3 mL空腹状态外周血，3 000 r/min离心处理10 min，分离血清，-80 ℃冷存待检;术后留存切除新鲜（离体30 min内）结肠癌组织（癌灶中心部）和癌旁组织（距肿瘤组织8～10 cm处）标本，移入EP管内，-80 ℃液氮冻存待检。每例患者均取癌组织及癌旁组织各1份用于实验研究。

1.2.3 CAP2 mRNA水平检测 以Trizol试剂盒提取总RNA，并测定RNA纯度、浓度。参照反转录试剂盒说明合成cDNA。以cDNA为模板，以GAPDH为内参行RT-qPCR扩增反应，反应体系为0.4 μL ROX Reference Dye（50×）、上、下游引物各0.8 μL、2.0 μL cDNA、6.0 μL ddH2O、10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，反应条件为95 ℃，10 min→95 ℃，15 s→60 ℃，30 s→72 ℃，60 s，共35个循环。引物序列见表1。根据2-ΔΔCt法计算CAP2的mRNA相对表达量[5]。

1.2.4 CAP2蛋白水平检测 （1）取组织石蜡包块，常规切片（4 μm）、脱蜡处理→（2）高压修复抗原→（3）阻断灭活内源性过氧化物酶→（4）滴加羊血清封闭→（5）滴加采用PBS稀释至1︰200兔抗人CAP2一抗，PBS冲洗→（6）滴加经辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗→（7）滴加链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶（SP）→（8）DAB显色→（9）苏木素复染→（10）脱水、透明、封片、镜检。设置PBS代替一抗为阴性对照。

1.2.5 结果判定 2位资深病理医师在仅知道患者性别、年龄等情况下单独阅片，×400倍光学显微镜下随机选择5个视野，每个视野选择100个细胞，根据阳性细胞占比与染色强度乘积（IS值）判定CAP2蛋白表达水平[6]，阳性细胞占比：占比<25%为0分、占比25%～50%为1分、占比51%～75%为2分、占比>75%为3分;染色强度：未染色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分，棕褐色为3分。IS值<3分为阴性（-），≥3分为阳性（+）。CEA阳性阈值为≥5 μg/L，CA19-9阳性阈值为≥37 kU/L。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。相关性行Kendall相关分析;诊断价值采用受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC曲线）评估，曲线下面积（area under curve，AUC）0.7～0.9时有一定准确性，>0.9准确性较高。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌及癌旁组织CAP2 mRNA及蛋白表达情况比较 结肠癌组织CAP2 mRNA表达水平明显高于癌旁组织（P<0.05）;结肠癌组织CAP2蛋白阳性表达率为70.00%，明显高于癌旁组织的16.00%（P<0.05）。见表2，图1、2。

2.2 不同临床病理特征的结肠癌组织CAP2蛋白表达情况 不同性别、年龄、肿瘤直径的结肠癌組织CAP2蛋白表达情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;不同分化程度、浸润程度、TNM分期、淋巴结转移、术前CEA及CA19-9水平的结肠癌组织CAP2蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.3 结肠癌组织中CAP2蛋白表达与术前血清CEA、CA19-9水平相关性 Kendall相关分析显示，结肠癌组织中CAP2蛋白阳性表达率与术前血清CEA、CA19-9均呈正相关（P<0.05），见表4、图3。

2.5 结肠癌组织中CAP2表达对结肠癌诊断价值分析 ROC曲线分析显示，CAP2 mRNA、CAP2蛋白对结肠癌的具有一定的诊断价值，AUC分别为0.895、0.770（P<0.05），见表5和图4、5。

3 讨论

研究表明，结肠癌发病率、死亡率分别位居胃肠恶性肿瘤第3、4位[7]。目前，尚无早期诊断结肠癌的有效手段，大多数患者确诊时已无手术切除可能，因而结肠癌预后较差。分析结肠癌组织异常表达生物分子水平与患者临床病理特征相关性，并探讨其对结肠癌诊断价值，可为结肠癌临床诊治提供新参考[8]。

腺苷酸环化酶相关蛋白（adenotide cyclase-related proteins，CAP）最早发现于酵母研究中，腺苷酸环化酶协同调节细胞信号转导过程中扮演关键角色[9]。CAP为具有多种生物活性的高度保守蛋白，在各种病理生理过程中可见CAP表达，其在人体中主要以CAP1、CAP2两种亚型存在。CAP1广泛分布于人体内，而CAP2主要分布于心肌、骨骼肌中[10-11]。国内外众多研究显示，CAP2在许多恶性肿瘤中表达异常，如Li等[12]研究中，胃癌组织CAP2蛋白表达明显升高，且其表达和TNM分期、浸润程度、淋巴结转移情况等密切相关;Saker等[13]指出，胶质瘤组织CAP2 mRNA及蛋白表达水平均异常升高，CAP2高表达与患者总生存率有关，对胶质瘤患者预后具有一定预测价值。

本研究表明，结肠癌组织CAP2 mRNA、CAP2蛋白表達水平均明显高于癌旁组织，且在分化程度低、浸润程度深、Ⅲ与Ⅳ期、淋巴结转移、术前CEA≥5 μg/L、术前CA19-9≥37 kU/L的结肠癌组织中CAP2蛋白阳性表达率更高，说明CAP2高表达和结肠癌发生、进展有关。分析可能机制为：（1）CAP2基因定位于细胞质内，可通过激活环磷酸腺苷（c-AMP）和丝裂原-激活蛋白酶激酶（MAPKs）促进结肠癌细胞增殖;（2）CAP2通过调节肌动蛋白及细胞骨架蛋白运动而促进结肠癌细胞侵袭、转移[14-15]。CEA系提取自结肠癌、胚胎组织中一种广谱肿瘤标志物[16];CA19-9系和胰腺癌、结肠癌、胆囊癌以及胃癌有关的肿瘤标志物[17]。Kendall相关分析显示，结肠癌组织中CAP2蛋白阳性表达率与术前血清CEA、CA19-9均呈正相关（P<0.05），提示CAP2蛋白和临床常用恶性肿瘤诊断指标具有较强关联性，为分子病理学结合血液学评估结肠癌发生、进展提供参考[18-20]。此外，ROC曲线显示，结肠癌组织中CAP2 mRNA、CAP2蛋白对结肠癌具有一定诊断价值（AUC=0.895、0.770，P<0.001）。

综上所述，结肠癌组织CAP2表达明显高于癌旁组织，且其高表达与患者分化程度、浸润程度、TNM分期、淋巴结转移、术前CEA、CA19-9水平密切相关，提示CAP2参与了结肠癌发生、进展，可能成为治疗结肠癌潜在靶点。

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（收稿日期：2021-07-26） （本文编辑：田婧）