循环肿瘤DNA与结直肠癌的研究进展

周鹏飞 廖正威 王培龙

【摘要】 结直肠癌（CRC）是一种恶性疾病，预后与结直肠癌的分期密切相关，所以早期诊断是生存的关键。随着精密医学的发展，液体活检已成为检测分子变化和肿瘤异质性的重要工具。近年来，循环肿瘤DNA（ctDNA）以其无创性、方便性、综合性、安全性等特点受到越来越多的关注。本文就ctDNA在CRC诊断、监测及预后方面的临床作用做一综述。

【关键词】 ctDNA 结直肠癌 诊断 监测 预后

Circulating Tumor DNA and Colorectal Cancer Research Progress/ZHOU Pengfei， LIAO Zhengwei， WANG Peilong. //Medical Innovation of China， 2021， 18（16）： -180

[Abstract] Colorectal cancer （CRC） is a malignant disease， and the prognosis is closely related to the stage of colorectal cancer， so early diagnosis is the key to survival. With the development of precision medicine， liquid biopsy has become an important tool for detecting molecular changes and tumor heterogeneity. In recent years， circulating tumor DNA （ctDNA） has received more and more attention due to its non-invasiveness， convenience， comprehensiveness， and safety. This article reviews the clinical role of ctDNA in the diagnosis， monitoring and prognosis of CRC.

[Key words] ctDNA Colorectal cancer Diagnosis Monitoring Prognosis

First-author’s address： Changzhi Medical College， Changzhi 046000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.16.042

结直肠癌（CRC）是一种严重的异质性疾病，在癌症发病率中居第三位，是世界第二大死因，每年有近180万新诊断患者和100万死亡患者[1]。结直肠癌已经成为世界的主要癌症，部分原因可能是人口老龄化和不良的生活习惯，如吸烟，红肉和酒精摄入量增加，缺乏运动，糖尿病，阳性的遗传家族史，肠道菌群多样性较低有关。筛查计划的目的是识别癌前病变或可切除的0、Ⅰ、Ⅱ期的患者，他们的预后通常比有症状的患者要好[2]。尽管有筛查计划，但许多患者被诊断时已经是Ⅲ和Ⅳ期，导致总体预后较差[3]。根据美国国家癌症研究所的数据，结肠癌（CC）和直肠癌（RC）Ⅳ期的五年生存率分别只有12%和13%[4];而早期发现Ⅰ期可以使CC和RC的存活率分别提高到92%和88%[5]。

传统的临床诊断方法包括血清肿瘤标志物、结肠镜、影像学和组织活检。癌胚抗原（CEA）和糖类抗原19-9（CA19-9）被用作血清肿瘤标记物，但由于缺乏敏感性和特异性，单独使用这两种标记物并不能完全满足临床需要[6]。肿瘤活检在临床上也有不足之处，由于严重的创伤和患者依从性差，很难进行重复活检来监测疾病进展。因此，循环肿瘤DNA（ctDNA）作为一种很有前途的结直肠癌診断工具应运而生。此外，从ctDNA获得的信息与组织活检具有互补性。结合来自ctDNA的信息可以克服与肿瘤异质性和有限的组织可用性相关的一些挑战。

1 ctDNA的来源

无细胞DNA（cfDNA）是高度降解的DNA片段，在外周血中可以检测到。在健康人中，绝大多数cfDNA来自造血系统。在一定生理或病理状态下，cfDNA的组成可能会发生变化。例如，怀孕女性的血液中含有胎儿的DNA片段，癌症患者的血液循环中含有肿瘤的DNA片段。后者也被叫做ctDNA，是由150～200个碱基对组成的片段。重要的是，ctDNA保留了表观遗传学特征，并携带可在外周血中检测到的肿瘤特异性突变[7]。ctDNA的正常半衰期小于1 h，表明ctDNA能反映肿瘤的动态特征。研究表明，ctDNA有多个来源，而不是单一来源[8]。ctDNA的三个主要来源是：（1）凋亡或坏死的肿瘤细胞;（2）活跃的肿瘤细胞;（3）循环中的肿瘤细胞[9]。由于ctDNA携带的遗传信息与肿瘤细胞完全相同，且存在于外周血中，因此ctDNA是诊断大肠癌的理想工具。

2 ctDNA在临床实践中的作用

2.1 早期CRC患者的诊断 大肠癌的早期诊断是提高疾病治愈率的关键。目前，早期诊断的主要方法是粪便潜血检测、直肠指检（DGE）和血清肿瘤标志物（CEA、CA19-9）分析。血清肿瘤标志物CEA的检测敏感性和特异性较低，不能完全满足临床需要。因此，ctDNA可能是诊断CRC的有利工具，特别是当其与CEA联合用于早期检测时[10]。一些研究表明，ctDNA甲基化在早期CRC患者中比传统的血清肿瘤标志物具有更高的敏感性，是一种潜在的诊断的生物标志物[11-12]。此外，最近的一项研究表明，单个ctDNA甲基化标记cg10673833可以在1 493名CRC参与者中产生高敏感性（89.7%）和特异性（86.8%）[13]。FDA批准临床应用的

Epi proColon试验被广泛用于筛查大肠癌患者cfDNA中SEPT9启动子的甲基化状态[14]。

除了癌症，血浆ctDNA水平在許多其他疾病中也可以观察到，包括心肌梗死、严重感染、炎症性疾病和妊娠[15-17]。在普通人群中，良性病变可能与癌细胞具有相同的突变，并可能将cfDNA释放到循环中[18]。因此，ctDNA水平的升高可能是非特异性的。为了克服这个问题，最近的一项研究发现，DNA片段长度分布呈现出不同的模式，健康人cfDNA片段的长度分布呈规律性;相反，来自癌症患者的ctDNA片段的长度分布是不规则的[19]。表明根据游离DNA片段长度的分布模式可以区分健康人和癌症患者。其他研究已经证实了包括KRAS、BRAF和TP53的肿瘤保守的基因突变。不幸的是，当检测结果为阳性时，很难将肿瘤定位于特定器官。在这种情况下，可以进行一种名为CancerSEEK的测试来评估循环蛋白水平和cfDNA突变。CancerSEEK对卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌和食管癌的敏感性为69%～98%，对所有肿瘤类型的特异性均大于99%，这些结果提供了CancerSEEK提高早期癌症检测水平的证据。最重要的是，CancerSEEK可以确定特定肿瘤类型的起源部位[20]。ctDNA主要来源于坏死性和凋亡性肿瘤细胞，因此有必要量化健康个体中cfDNA的有效水平，以建立更好的早期诊断阈值。所以，ctDNA领域需要大样本研究的支持，并且检测方法必须标准化后才能用于临床癌症诊断。

2.2 微小残留病和复发监测 进行手术或根治性治疗后，即使在没有任何其他临床疾病证据的情况下，ctDNA的检测也可能标志着微小残留病（MRD）的存在。可以对基于ctDNA的液体活检进行优化，以在根治性切除后和在临床或放射学复发之前捕获和监测MRD[21]。一项前瞻性队列研究报告了ctDNA检测的230例Ⅱ期结肠癌患者的1 046份血浆样本中MRD的能力[22]。在未进行辅助化疗的患者中，178例患者中有14例（7.9%）在术后检测到ctDNA，这14例患者中有11例（78.6%）在随访期间发现放射学复发[22]。相比之下，178例患者中的其余164例（92.1%）术后ctDNA阴性，只有16例（9.8%）的患者发现疾病复发。在接受化疗的患者中，化疗完成后，ctDNA的存在也与无复发生存期（RFS）缩短有关（P=0.001）[22]。另一项研究也报告了在计划进行新辅助放化疗的局部晚期直肠癌（T3、T4、淋巴结转移阳性）患者中，ctDNA检测MRD的能力[23]。虽然在治疗前可检测到ctDNA的患者与未检测到ctDNA的患者在RFS方面没有差异，但ctDNA阳性的患者在放化疗或手术后复发的风险增加[放化疗：危险比（HR）=6.6（P<0.001）;手术：HR=13.0（P<0.001）][23]。术后ctDNA阳性患者的3年RFS估计为33%，而术后ctDNA阴性患者的3年RFS大约为87%。这些数据表明，不管是否使用辅助化疗，术后ctDNA检测对预测复发可能是有用的。因此，基于ctDNA对复发风险较高的患者进行筛查可能会为临床转移前的治疗干预创造机会。

2.3 监测CRC的治疗反应 传统上用于监测晚期CRC的方法有CEA、影像学（CT、MRI）和结肠镜检查。然而，CEA由于其低敏感性和特异性而在临床实践中具有明显的局限性[24]。因此，需要更好的生物标志物来监测治疗反应，而ctDNA是合适的选择。如前所述，由于ctDNA的半衰期很短，因此可以实时监测肿瘤负荷。与成像方法相比，序列ctDNA分析可以用来提前几周到几个月追踪治疗反应，这可以提供足够的时间来调整治疗策略和防止疾病进展[25]。血浆ctDNA水平与患者化疗后预后不良有关[26]。文献[27]报道，化疗后ctDNA水平下降10倍的患者比ctDNA水平下降<10倍的患者有更长的无进展生存期[中位数无进展生存期：14.7个月vs 8.1个月，HR=1.87，95%CI（0.62，5.61）]。

除了识别治疗无效的个体外，ctDNA还可以用来评估晚期患者的肿瘤负荷，并指导后续的治疗决定。Vidal等[28]注意到ctDNA的动态变化可以反映疾病的进展，并且这些变化在诊断成像发生之前是可以测量的。最近的一项回顾性研究证实，在一线药物以奥沙利铂为基础的化疗前，ctDNA可作为转移性结直肠癌（mCRC）的预后生物标志物[29]。另外，文献[30]中ctDNA还评估了阿帕替尼对难治性mCRC患者的单药治疗效果。mCRC患者外周血中ctDNA水平高于非转移性大肠癌患者外周血中ctDNA水平。监测晚期CRC患者的治疗反应具有重要的临床意义，作为一种重要的工具，ctDNA可以为晚期疾病患者提供更好的治疗策略，并具有更大的潜力来补充实体肿瘤反应评估标准（RECIST）评估[31]。

新辅助放化疗（NCRT）被广泛应用于局部晚期直肠癌（LARC）的治疗。50%～60%的直肠癌患者在新辅助放化疗后肿瘤消退，其中病理完全应答（PCR）高达20%[32]。为了避免晚期LARC患者术后并发症，提高生活质量，一些研究人员提出了“观察等待”的策略。先前的研究证实直肠癌患者对新辅助治疗的反应与疾病预后有关[33]。Yang等[34]建议可以使用ctDNA将LARC患者分为高危或低危亚组，选择适合于“观察和等待”的策略。尽管ctDNA可以为治疗决策提供有价值的信息，但仍需要进行前瞻性研究来评估后续治疗策略。在临床实践中，ctDNA在改善治疗监测方面具有很大的潜力。它避免了常规CT扫描的辐射暴露，比CEA具有更高的敏感性。因此，ctDNA可用于更好地识别疾病进展，并可以及时调整治疗策略。

2.4 转移性患者的治疗耐药性 具有野生型KRAS/NRAS/BRAF的mCRC患者通常对最初的抗EGFR治疗敏感。然而，肿瘤通常在治疗的最初几个月内产生获得性耐药，这是接受靶向肿瘤治疗的个体治疗失败的主要原因。在抗EGFR治疗过程中获得性耐药的机制被归因于旁路信号通路的激活和EGFR受体的继发性改变[35]。大约40%的大肠癌患者有KRAS外显子2的第12、13密码子突变[36]。一些研究表明，KRAS外显子2的突变预示着抗EGFR（西妥昔单抗和帕尼单抗）治疗失败[37]。获得性耐药的机制在抗EGFR治疗中较为复杂，在临床实践中难以追踪。

然而，由于ctDNA可以用于无创、实时监测EGFR信号通路的异常，因此它可以作为一种策略来识别mCRC患者对抗EGFR治疗的获得性耐药，并指導后续的治疗。回顾性分析表明，在接受抗EGFR治疗时，最初为KRAS野生型的患者可以发生KRAS突变[38]。也有其他研究发现，西妥昔单抗治疗后10个月内出现KRAS突变[39]。这些结果表明，KRAS突变是抗EGFR治疗获得性耐药的主要机制，通常在治疗后发生。由于同一患者体内的不同肿瘤病变会出现不同的耐药机制，所以ctDNA可能是一种强大的工具。序列ctDNA监测的平行分析可以非侵入性地追踪这些突变，以减少组织活检造成的不良影响，并指导后续治疗[40]。目前，抗EGFR再挑战策略对获得性耐药患者有效[41]。西妥昔单抗联合伊立替康作为三线治疗对于在产生耐药性之前接受相同治疗方案作为一线治疗的患者有效。可以通过分析ctDNA，选择适合重新挑战策略的患者[42]。

HER2与EGFR属于同一信号激酶受体家族。值得注意的是，HER2在乳腺癌患者中的成功靶向已经在晚期和辅助环境中实现。HER2在结直肠癌中过表达是罕见的，仅在大约3%的患者中发生[43]。有趣的是，野生型KRAS/NRAS/BRAF患者的HER2过度表达率为5%～14%[43]。HER2过表达也提示抗EGFR治疗失败。一项研究表明，可以用ctDNA非侵入性地检测HER2的过度表达，并用于预测抗HER2靶向治疗的疗效[44]。在目前的免疫治疗中，高频微卫星不稳定（MSI-H）状态的肿瘤对免疫检查点抑制剂（ICBS）敏感，但该亚群中近一半的患者具有先天性抵抗力。Wnt/β-catenin通路的激活可导致免疫排斥反应和对ICBS的抵抗。最近的研究表明，同样对ICBS耐药的MSI-H患者存在RNF43突变和APC或CT-NNB1的额外突变。有研究还表明，Wnt/β-catenin通路的激活促进了耐药机制[45]。对ctDNA的分析以确定耐药机制，突出了液体活检的临床潜力。系列ctDNA分析可以识别组织活检种没有捕捉到的继发性耐药机制，同时预测治疗失败的时间和原因。这些分析对指导临床治疗策略有重要意义。

3 展望

CRC的发生发展是一个从良性腺瘤到浸润性癌的表观遗传和结构修饰的综合过程。早期发现并在内窥镜下完全切除腺瘤是生存的关键，这样肿瘤发展的概率几乎为零。ctDNA已经被FDA批准为CRC的诊断标志物，具有广阔的前景。但仍然存在着许多未解决的问题：（1）难以从cfDNA中分离出特定的ctDNA片段;（2）当ctDNA提示高复发风险，但影像学检查未提供明显的证实，是否需要强化治疗。毋庸置疑，ctDNA的主要优势在于它为精密医学提供了更好的指标，并且摆脱了肿瘤组织活检的局限性。此外，ctDNA可以进行非侵入性治疗监测，并可以为预后评估提供依据。随着科学技术的飞速发展，液体活检必将在CRC的诊断和治疗中发挥关键作用。

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（收稿日期：2020-08-24） （本文編辑：田婧）