酶法提取淡水鱼内脏鱼油的工艺优化

顾盼祺，魏晓倩，赵利，陈丽丽，江勇，白春清，袁美兰

(江西科技师范大学 生命科学学院，国家淡水鱼加工技术研发分中心(南昌)，南昌 330013)

淡水鱼是一种营养丰富、蛋白质含量高的水产食物，是我国人民日常生活饮食的主要蛋白质来源之一。目前大多数淡水鱼的加工仅局限在利用鱼体肌肉，比如鱼片、冷冻鱼糜、鱼丸等的生产，而对鱼内脏、鱼头、鱼骨、鱼皮、鱼鳞等下脚料的加工利用较少。据有关统计，我国每年淡水鱼副产物产量超过250万吨，除了一

小部分被加工成饲料外，绝大部分被直接丢弃，这必定会对环境造成一定污染，甚至引发疾病[1]。鱼类加工副产物中普遍存在多种生物活性物质，如胶原、糖胺聚糖、多不饱和脂肪酸、磷脂、维生素、酶、活性肽等[2]，因此具有一定的开发利用价值。对这类副产物进行深层次的加工处理，如用于生产鱼油、鱼露、内脏鲜味酱、鱼酱油等辅助食品[3-6]，既可以提高水产品加工的附加值，又可以避免直接丢弃而污染环境。

鱼油富含ω-3系多不饱和脂肪酸，其具有较高的营养价值和保健功效[7]，并且鱼油还可用于制备具有独特风味的鱼味香精等风味添加剂，满足人们的饮食需求。因此鱼油已成为近年来研究的热点之一。但深海鱼类资源有限，且其鱼油提取成本高，所以淡水鱼成为鱼油提取的新选择[8]。目前，鱼油的提取方法主要有有机溶剂法、蒸煮法、淡碱水解法、酶解法和超临界流体萃取法等[9-13]。其中，酶解法是鱼油提取的主要方法之一，是利用蛋白酶对蛋白质的水解作用，破坏蛋白质和鱼油的结合关系，从而释放出鱼油。相对于传统淡碱水解法而言，酶法水解不但可以增产，还可充分利用酶法水解产生的蛋白酶水解产物，使资源得到充分利用。本研究通过酶解法来制备鱼油，运用单因素试验和正交试验得出酶法提取鱼油的最佳条件，旨在寻找一种从淡水鱼内脏中提取鱼油的合适方法，期望能更简便快速并且高效地处理鱼内脏，提高其经济价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜淡水鱼内脏；木瓜蛋白酶(800000 U/g)、碱性蛋白酶(200000 U/g)：北京索莱宝科技有限公司；中性蛋白酶(100000 U/g)：诺维信生物技术有限公司；盐酸：西陇化工股份有限公司；氢氧化钾：上海山浦化工有限公司。

1.2 试验仪器

试验仪器见表1。

表1 仪器列表Table 1 The list of instruments

1.3 试验方法

1.3.1 样品的前处理

去掉新鲜淡水鱼内脏的胆，剩余部分用蒸馏水清洗干净并沥干水后，放入高速组织捣碎机内搅拌成糜状，用保鲜袋封装冷藏备用。

1.3.2 淡水鱼内脏酶解工艺

称取20 g经处理的淡水鱼内脏糜，放入锥形瓶中，加蒸馏水，调节pH，加入一定量蛋白酶粉末。在一定温度下对其酶解一定时间后，进行灭酶处理，趁热使用离心机在4500 r/min的速度下离心15 min，吸出上层鱼油，称取所得鱼油的质量。

1.3.3 鱼油得率的计算

鱼油得率(%)=提取鱼油的质量(g)/原料的质量(g)×100%。

1.4 酶种类对淡水鱼内脏鱼油得率的影响

选用3种蛋白酶(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)作为试验用酶，在包装标示的各自最适温度和pH条件下进行酶解提取鱼油。其他酶解条件为：酶加入量2%，料液比1∶1(原料∶蒸馏水)，酶解时间4 h，然后离心、收集鱼油并称重，计算得率，研究酶种类对鱼油得率的影响。

1.5 单因素试验

1.5.1 pH值对鱼油得率的影响

以上述得到的最佳酶作为试验用酶，在酶加入量2%，温度50 ℃，料液比1∶1，酶解时间4 h的条件下，研究酶解pH为5，6，7，8，9时对鱼油得率的影响。

1.5.2 酶解时间对鱼油得率的影响

在酶加入量2%，温度50 ℃，料液比1∶1以及1.5.1得到的pH值条件下，研究酶解时间为20，40，60，120，180，240，300 min时对鱼油得率的影响。

1.5.3 酶解温度对鱼油得率的影响

在酶加入量2%，料液比1∶1以及前面得到的最佳pH值和酶解时间条件下研究酶解温度为30，40，50，60，70 ℃时对鱼油得率的影响。

1.5.4 酶添加量对鱼油得率的影响

在前面得到的最佳pH值、酶解温度和酶解时间以及料液比1∶1的条件下研究蛋白酶添加量在0.30%、0.60%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%时对鱼油得率的影响。

1.5.5 料液比对鱼油得率的影响

在前面得到的最佳pH值、酶解时间、酶解温度和酶加入量条件下研究料液比为1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶4时对鱼油得率的影响。

1.6 正交试验

根据单因素试验结果，将中性蛋白酶固定为水解酶，选择pH、酶解温度、酶解时间、料液比和加酶量为试验因素，以淡水鱼油得率为指标，根据 L16(45)正交表进行正交试验，优化酶解条件。正交试验因素与水平设计见表2。

表2 正交试验因素与水平设计Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶种类对淡水鱼内脏鱼油得率的影响结果

由图1可知，用不同蛋白酶酶解淡水鱼内脏，其对鱼油得率的影响不同。由于不同酶对肽键的专一性不同，因此不同蛋白酶展现出的水解能力不同。用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶在各自的最佳酶活条件下酶解淡水鱼内脏的试验中发现，中性蛋白酶的酶解效果最好，鱼油得率最高，达29.23%；碱性蛋白酶的提取率最低，这与王正云等[14]在研究微波辅助酶法提取青鱼内脏鱼油中，酶种类对鱼油得率影响的试验的结果基本一致。木瓜蛋白酶的提油率比中性蛋白酶的略低，但木瓜蛋白酶的价格较为昂贵，基本上是中性蛋白酶价格的2倍[15]，对应用于工业生产来讲花费较高。因此，后续试验选择中性蛋白酶。

图1 蛋白酶种类对鱼油得率的影响

2.1.2 pH值对鱼油得率的影响结果

由图2可知，酶解pH在5～6范围内，鱼油产量随着pH值的升高而增加，表明pH升高可以促进蛋白水解，有利于鱼油的释放。当pH值为6时，鱼油得率取得最高值，为30.82%；pH在6～7之间，鱼油得率略有下降；pH为7时的鱼油得率为29.61%，pH进一步增大，鱼油得率则明显下降。由此可见，不同酶其pH值适宜范围不同，酶活性也会因此受到不同程度的影响，过酸或过碱均会引起酶活性降低，甚至导致酶不可逆性失活或者影响酶反应的动力学参数[16]。因此，选定酶法水解pH 为6。

图2 pH值对鱼油得率的影响

2.1.3 酶解时间对鱼油得率的影响结果

由图3可知，随着酶解时间的延长，鱼油得率缓慢增长，原因是随着酶解时间的增长，酶与底物反应充分，从而破坏了脂肪和蛋白质的结构关系。酶解4 h后，鱼油得率达到最高点，王倩倩等[17]在罗非鱼油的提取中，也证明酶与底物的反应随着酶解时间的延长，提取出油脂的含量更高，然而，继续酶解鱼油得率开始下降，这可能是因为中性蛋白酶随着时间的增加与底物接触较为充分，基本达到平衡的作用状态[18]。此外，淡水鱼下脚料中提取的鱼油在空气中暴露的时间越长，鱼油中的不饱和脂肪酸被氧化的越多，这不但会使鱼油的品质受到影响，而且会增加能源的消耗[19]。单因素方差分析后发现，酶解时间对鱼油得率影响不显著，即在所试验的酶解时间内，随着酶解时间的增加，鱼油得率变化不明显(p>0.05)，但所提取的鱼油的色泽由淡黄色转变为棕褐色，且提取鱼油的周期也越长。为了生产工艺经济效益最大化，故选定酶法水解20 min为宜。

图3 酶解时间对鱼油得率的影响

2.1.4 酶解温度对鱼油得率的影响结果

由图4可知，鱼油得率随着酶解温度的升高而逐渐升高，当酶解温度为30～50 ℃范围内时，鱼油得率升高明显。当酶解温度大于50 ℃时，鱼油得率上升缓慢，这是由于温度的升高加快了高分子热运动，促使酶与底物更加充分地接触，进而促进酶解，但温度过高会使鱼油的色泽加深，腥味变重，降低鱼油的品质。综合考虑，酶法水解温度以50 ℃为宜。

图4 酶解温度对鱼油得率的影响

2.1.5 酶添加量对鱼油得率的影响结果

由图5可知，随着酶添加量的增加，鱼油得率呈先上升随后略有下降的趋势。当酶添加量小于1.5%时，鱼油得率随着酶添加量的增加而缓慢提高，当酶加入量大于1.5%时，随着加酶量继续增大，得率降低。其原因可能是加酶量不足1.5%时，底物未达到饱和，加酶量达到1.5%时底物已经饱和，继续增大加酶量对水解促进效果不佳，甚至导致部分酶丧失催化活性。张金哲等[20]研究以鲤鱼内脏为原料用酶解法提取油脂的试验中，发现随着酶添加量的不断增加，提油率有先增长再下降的现象，这与本试验结果相似。在酶添加量为0.3%～1.5%时，鱼油得率差异不大(p>0.05)，因此，为了生产工艺经济效益最大化，最优酶加入量为0.3%。

图5 酶添加量对鱼油得率的影响

2.1.6 料液比对鱼油得率的影响结果

由图6可知，当料液比为1∶1时鱼油得率最佳，料液比持续增加，鱼油得率反而逐渐下降。可能是淡水鱼内脏本身含水量较高，底物浓度相对较合适，增加料液比会增加水分的含量，使底物的浓度被稀释，影响了酶解速度，酶解效果变差，从而降低了鱼油得率。故选择最适料液比为1∶1。

图6 料液比对鱼油得率的影响

2.2 酶解工艺的优化

依照单因素试验结果选择pH、酶解时间、酶解温度、酶添加量和料液比进行正交试验，正交试验结果分析和方差分析见表3。

表3 正交试验数据及极差分析表Table 3 The orthogonal experimental data and range analysis

由表3极差分析可知，影响中性蛋白酶水解淡水鱼内脏提取鱼油的各因素主次顺序为B>C>A>E>D，即酶解时间>酶解温度>pH>料液比>酶添加量。采用中性蛋白酶水解淡水鱼内脏提取鱼油的最佳条件为A4B4C4D3E4，用酶解法提取鱼油的最优条件为：pH 7，酶解时间40 min，酶解温度60 ℃，酶添加量0.50%，料液比(原料∶蒸馏水)1∶1.5。在以上最优的条件下进行鱼油提取的验证试验得到的鱼油得率为35.67%。

3 结论

本文以淡水鱼内脏为原材料，以淡水鱼鱼油得率为指标，通过单因素试验和正交试验对酶法提取鱼油的工艺条件进行优化，得到了鱼油提取的最佳工艺条件为：选择中性蛋白酶，pH为7，酶解时间为40 min，酶解温度为60 ℃，酶添加量为0.50%，料液比为1∶1.5。在最佳条件下，鱼油得率可达35.67%。本研究结果为淡水鱼内脏的开发利用提供了一定的研究基础。