益母草提取物对粉尘螨杀灭活性及机制研究

何萌萌，秦浩远，余晚凤，褚凌渺，冯 蕊，范冬青，李 磊，柴晶晶，陈 冰，孙恩涛*

(1.皖南医学院 检验学院，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院 基础医学院，安徽 芜湖 241002)

粉尘螨(

Dermatophagoides

farinae

)属疥螨目(Sarcoptiformes)、麦食螨科(Pyroglyphidae)，是强烈的吸入性过敏原，其排泄物中所含的酶、蜕皮产生的皮屑、腺体分泌物或唾液、尸体分解时产生的可溶性蛋白等都具有强致敏性，可诱发哮喘、过敏性鼻炎、湿疹等多种过敏反应性疾病。研究发现，粉尘螨主要以人类或动物身上掉下来的皮屑为食，所以广泛分布于人类的活动场所，尤其卧室居多，而减少环境中的尘螨数量或减少与尘螨的接触时间，可以大大缓解过敏患者的症状，降低尘螨导致过敏性疾病的发病率。目前，杀螨剂主要用于防治植食性害螨，也可辅助用于室内杀螨，是防控螨类的重要手段。有报道表明，部分化学杀螨剂因高毒高风险被逐渐淘汰，致使生物杀螨剂越来越受到重视。全球已报道具有杀虫活性的植物提取物超过1 005种，其中39种有杀螨活性，主要包括植物粗提物、生物碱类、黄酮类、柠檬素类和植物精油类等杀螨活性成分，且防效良好。我国中草药数量众多、种类丰富，从中筛选出高效、经济、对环境友好的天然杀螨活性成分已成为研究热点之一。益母草(

Leonurus

japonicus

Houtt)又名坤草，为唇形科益母草属1年或2年生草本植物，以其地上部分的干燥全草入药，具有活血调经、利尿消肿、清热解毒之功效，临床多用于妇产科疾病的治疗且效果显著。在益母草相关研究中，徐心植等研究报道了提取分离自益母草的水苏碱和益母草碱对柑桔全爪螨有触杀活性，且王睿研究发现各益母草杀螨活性物质提取溶剂中水的提取率最高，但益母草提取物对粉尘螨的生物活性及解毒代谢酶系的影响尚未见报道。研究以水为提取溶剂，进行室内生物测定，对益母草提取物的杀螨活性及作用机制进行初步探究，旨在为粉尘螨的防治及新型植物源杀螨剂的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

益母草干粉购自陕西康泰生物有限公司，密封避光保存。粉尘螨成螨源自实验室纯培养，于23.5±1 ℃、RH75%±10%的人工培养箱内保存。乙酰胆碱酯酶(AChE)活性检测试剂盒和还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测试剂盒购自Solarbio公司；单胺氧化酶(MAO)试剂盒、CaMg-ATP酶活性测定试剂盒、多功能氧化酶(MFO)试剂盒、羧酸酯酶(CarE)活性测定试剂盒均购自苏州科铭生物；BCA法微量蛋白质浓度测定试剂盒购自上海生工。

1.2 方法

(1)药液配置。参考高岐等利用微波加热技术，称取不同质量的益母草干粉(1 g、1.5 g、2 g、2.5 g)，以去离子水为提取溶剂配置成100 mL的溶液，微波提取时间为8 min、功率为616 W，对益母草中总生物碱进行微波提取，得到浓度分别为0.01 gDW/mL，0.015 gDW/mL，0.02 gDW/mL，0.025 gDW/mL(1 gDW/mL为1 mL水溶液中含有1 g干植物的提取物)的提取液。

(2)触杀活性测定。改良自FAO推荐的玻片浸渍法，用双面胶纸将活动正常、大小一致的粉尘螨成螨背部向下粘于载玻片的一端，每玻片30头，在各组不同浓度药液中浸8 s后取出，用吸水纸吸去虫体上的浮药，放入装有湿棉花的透明盒中再放入恒温培养箱(温度23.5 ℃，RH 70%～80%)。分别于24 h、48 h、72 h观察其死亡情况，用毛笔尖轻触螨体，肢体不动者判断为死亡。用清水做空白对照，每一浓度重复3次，记录实验数据。

(3)熏蒸活性测定。参考FAO的方法，将粘有30头粉尘螨成螨的玻片胶纸面朝下，斜插放入容量为1 000 mL、装有等量不同浓度药液的广口试剂瓶中，注意螨体不与药液接触，迅速盖上瓶盖密封。将广口瓶置于23.5 ℃恒温培养箱内，全黑暗条件下进行熏蒸。每一浓度3次重复，并设空白对照，分别观察24 h、48 h、72 h的死亡情况，记录实验数据。

(4)酶活性测定。从培养基中挑取1 000只粉尘螨成螨于1.5 mL灭菌EP管中，用以上测得杀螨活性最高浓度的益母草提取物药液分别处理不同时间(0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)，去除螨体组织残留药液后用液氮充分研磨，-80 ℃保存备用。乙酰胆碱酯酶(AChE)、CaMg-ATP酶、单胺氧化酶(MAO)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、多功能氧化酶(MFO)和蛋白酶的活性测定分别参照各自的酶联免疫吸附测定试剂盒。以清水代替药液,其余条件相同,设置对照组，处理组与对照组均重复3次，统计实验数据。

(5)统计分析。用Abbott公式对死亡率进行校正：

数据用SPSS 17.0处理，采用Duncan氏新复极差显著性测验(Duncan's Multiple-Range Test)。

2 结果与分析

2.1 益母草提取物对粉尘螨的触杀活性

浸渍法测试益母草提取物对粉尘螨的杀灭活性如表1所示。由表1可知，益母草提取物对粉尘螨有良好的触杀活性，且触杀活性随处理浓度的升高而增强。在供试浓度为0.01 gDW/mL时，24 h校正死亡率为26.80%；而当供试浓度为0.025 gDW/mL时，24 h校正死亡率为96.10%，与其他处理有显著差异(P<0.05)。当益母草提取物浓度相同时，随着处理时间的延长，其触杀活性也增强。

表1 浸渍法测试益母草提取物对粉尘螨的杀灭活性

2.2 益母草提取物对粉尘螨的熏蒸活性

通过熏蒸试验发现，益母草提取物对粉尘螨的熏蒸活性较低，不同浓度药液处理24 h、48 h校正死亡率均低于50%，且差异不显著(P>0.05)。在供试浓度为0.02 gDW/mL时，24 h的校正死亡率仅为5.89%，而72 h校正死亡率为39.25%(P<0.05)。可知随着作用时间的延长，其校正死亡率有所升高，熏蒸作用杀螨效果与作用时间呈正相关，熏蒸法测试益母草提取物对粉尘螨的杀灭活性如表2所示。

表2 熏蒸法测试益母草提取物对粉尘螨的杀灭活性

2.3 益母草提取物对粉尘螨体内酶活性的影响

(1)对乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响。益母草提取物对粉尘螨AChE活性的影响如图1所示。由图1可知，益母草提取物处理粉尘螨后，处理组与对照组AChE活性变化趋势相似，两组活性变化趋势均为4 h内上升，4～8 h降低，8～16 h活性持续升高。处理组AChE活性于16 h最高，比活力为0.456 OD·min·mL；16 h前处理组活性高于对照组,16～24 h处理组与对照组活性均降低，且处理组活性低于对照组，说明AChE被先激活后抑制。

(2)对CaMg-ATP酶活性的影响。益母草提取物对粉尘螨CaMg-ATP酶活性的影响如图2所示。由图2可知，CaMg-ATP酶活性总体呈先上升后下降的变化趋势。20 h内活性上升且处理组高于对照组；20～24 h内处理组活性显著降低，而对照组活性下降不明显，表明对CaMg-ATP酶活性的影响为先激活后抑制。

图1 益母草提取物对粉尘螨AChE活性的影响 图2 益母草提取物对粉尘螨Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影响注：不同小写字母表示不同时间下对照组虫体内酶活性差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示不同时间下处理组虫体内酶活性差异显著(P<0.05)。下图同。

(3)对单胺氧化酶(MAO)活性的影响。益母草提取物对粉尘螨MAO活性影响如图3所示。由图3可知，处理组与对照组MAO活性在4 h内上升，4～8 h活性下降，而后随着作用时间的延长，MAO活性变化不显著。MAO活性在24h内处理组均高于对照组，说明益母草提取物可激活MAO。

(4)对羧酸酯酶(CarE)活性的影响。益母草提取物对粉尘螨CarE活性影响如图4所示。由图4可知，CarE活性在24 h内呈下降趋势。处理组与对照组活性变化较为相似，处理组活性在4 h内迅速下降；4～20 h活性上下波动；20～24 h活性急速下降，处理24 h活性降至最低。除8 h处理组活性高于对照组外，其余时间处理组活性均低于对照组，可得益母草提取物对CarE有显著的抑制作用。

图3 益母草提取物对粉尘螨MAO活性的影响图4 益母草提取物对粉尘螨CarE活性的影响

(5)对谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)活性的影响。益母草提取物对粉尘螨GSTs活性的影响如图5所示。由图5可知，处理组GSTs活性均低于对照组，24 h内活性变化趋势均为下降。总体来看，处理组与对照组活性变化趋势基本相同，整个过程中处理组GSTs活性均低于对照组，可得出益母草提取物使GSTs活性降低，对GSTs有抑制作用。

(6)对多功能氧化酶(MFO)活性的影响。益母草提取物对粉尘螨MFO活性的影响如图6所示。由图6可知，处理组与对照组MFO活性变化差异显著。处理组MFO活性在4 h内迅速上升，4 h MFO活性最高比活力为0.196 OD·min·mL；4～24 h MFO活性先急速降低后持续缓慢下降。8 h内处理组MFO活性高于对照组，此后均低于对照组，说明益母草提取物对MFO活性影响表现为先激活后抑制。

图5 益母草提取物对粉尘螨GSTs活性的影响图6 益母草提取物对粉尘螨MFO活性的影响

图7 益母草提取物对粉尘螨蛋白酶活性的影响

(7)对蛋白酶活性的影响。益母草提取物对粉尘螨蛋白酶活性的影响如图7所示。由图7可知，蛋白酶活性变化幅度不大，且处理组与对照组活性变化趋势差异不明显。8 h内处理组蛋白酶活性高于对照组，即蛋白酶被激活；12～16 h内处理组活性低于对照组，即酶活性被抑制；20～24 h内活性上升，蛋白酶被再次激活，可知益母草提取物对蛋白酶活性影响较复杂，表现为先激活，后抑制，再激活的波动性。

3 讨论

研究采用微波法以水为提取溶剂制备供试药液，并同时采用玻片浸渍法和熏蒸法分别测定益母草提取物对粉尘螨的触杀活性和熏蒸活性。在触杀活性实验结果中，0.025 gDW/mL的供试药液24 h校正死亡率为96.10%，说明益母草提取物对粉尘螨有良好的触杀活性。0.01 gDW/mL的益母草提取物处理24 h、48 h、72 h的校正死亡率分别为26.80%、29.41%、39.25%，而0.20 gDW/mL益母草提取物处理24 h、48 h、72 h的校正死亡率分别为39.87%、60.79%、76.29%。这与表皮穿透动力学中，穿透速度与所用药剂的浓度成正比，并和穿透时间成指数关系的结论相同，可知浓度的升高或作用时间的延长，都可使校正死亡率升高，其触杀活性也增强。

熏蒸活性测定结果表明，不同浓度药液熏蒸处理24 h、48 h、72 h的校正死亡率均低于50%，益母草提取物对粉尘螨有熏蒸活性但较低。随着处理时间的延长，校正死亡率逐渐升高，24 h、48 h、72 h后0.02 gDW/mL益母草提取物对粉尘螨的校正死亡率分别为5.89%、26.8%和39.25%。有研究表明，熏蒸活性随时间延长而增强的结果类似，可能是由于活性物质逐渐穿透螨体表皮层破坏其体壁结构，抑制作用增强，致使粉尘螨正常生理生化代谢受阻。通过研究结果可初步推测，相较于熏蒸活性，益母草提取物对粉尘螨的触杀活性更高。

研究已基本明确益母草提取物对粉尘螨有杀灭活性，但其杀螨作用机制尚不明确。由于杀螨机制的研究对杀螨剂的开发应用至关重要，因此通过测定益母草提取物作用不同时间后，粉尘螨体内7种酶的活性对此进行探究。神经毒素类杀螨剂是杀螨剂中最大的一类化合物，有研究表明大多数杀螨剂都是通过干扰神经功能达到致死作用。乙酰胆碱酯酶(AChE)是神经传导中的关键酶，也是神经毒素类杀虫剂的作用靶标。研究表明，AChE先被益母草提取物激活后被其抑制，说明螨体内神经传导活动先被促进后被阻断。益母草提取物对CaMg-ATP酶活性的影响为先激活后抑制，抑制作用可能致螨体细胞内Ca“超载”，从而引起神经传递的阻断。单胺氧化酶(MAO)可催化一些神经突触的传递物质神经胺，同时是多数杀虫剂的主要靶标。研究中MAO被持续激活，刺激神经传导过度兴奋，从而破坏神经活动的正常进行。研究结果表明，益母草提取物作用于粉尘螨后，螨体内AChE和CaMg-ATP酶都受到了一定程度的抑制，而MAO被激活，可能会引起神经系统功能紊乱从而导致粉尘螨的死亡。

羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)是昆虫体内三大主要解毒代谢酶系，可防御来自外界的有毒物质。CarE和MFO对内、外源有毒物质的解毒代谢及杀虫剂的抗性形成起重要作用，而GSTs具有保护体内蛋白质、核酸等作用。研究中，益母草提取物对以上三种酶均有抑制作用，推测其作用机制是解毒酶不能与提取物中的有毒物质结合，使益母草提取物无法在到达作用位点前被阻隔或降解，从而导致螨体内组织损伤进而导致死亡。蛋白酶是生物体内的主要消化酶系，蛋白酶活性的升高或降低将直接影响生物体对蛋白质的吸收和利用，其影响程度与试螨在外源有毒化合物作用下(尤其在死亡前)体内发生的一系列生理生化反应有关。研究中蛋白酶活性表现为波动性变化，推测益母草提取物能影响粉尘螨体内的蛋白质代谢活动。

研究结果初步表明益母草提取物对粉尘螨具有触杀活性，熏蒸活性较弱；推测其作用机制与神经系统有关，也与解毒代谢活动关联。对此笔者会继续研究，为将益母草进一步开发为特异性高、对人畜安全、低毒且长期使用不易产生抗药性的新型绿色环保杀螨剂提供理论基础。