植物SHMT 基因家族研究进展

倪弦之，柏浩东，韩进财，罗丁峰，李祖任，胡一鸿，金晨钟

（1.湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南 娄底 417000；2.湖南省农业科学院，杂草生物学及安全防控生物学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125）

丝 氨 酸 羟 甲 基 转 移 酶（Serine hydroxymethyl transferase，SHMT）是高等植物的一碳化合物代谢和光呼吸过程的关键酶，属于磷酸毗哆醛依赖酶。该酶可以催化甘氨酸和N5，N10-亚甲基四氢叶酸生成丝氨酸和四氢叶酸（THF），且该过程可逆[1]，反应式如下。

SHMT 广泛存在于原核生物和真核生物中，其在原核生物中是由单基因编码并以二聚体形式存在；而在动物和真菌中，SHMT 则是由不同的核基因编码的具有2 种异构型的四聚体[2]。近年来由于SHMT 可用于体外催化生产丝氨酸而备受关注，同时该物质对植物多种生理功能具有调节作用，因此关于植物SHMT的相关研究越来越多，也越来越深入。笔者主要对不同植物体内SHMT 的多种构型、克隆、逆境表达及其在植物保护上的应用研究进展进行综述，以期为植物SHMT 基因家族的功能及其相关应用研究提供参考。

1 植物SHMT 基因家族

SHMT 基因在植物界是非常广泛且重要的存在。植物界SHMT 基因家族同时也是一个神秘而庞大的家族。目前的研究显示，在拟南芥中，已经鉴定出7 个SHMT 基因[3]；在水稻中，OsSHMT 家族有5 个成员[4]；在大豆中，GmSHMT 大豆基因组包含大量的SHMT基因，约有18 个成员[5]。

植物的光合作用分为光反应和暗反应2 个过程。光反应发生在叶绿体类囊体膜上，光合色素吸收光能后进行电子传递，形成光合作用所需的能量和还原力（ATP 和NADPH）；而暗反应在叶绿体基质中进行，是光合作用碳同化过程[1]。已有研究表明，植物体中存在3 种形式的SHMT，即细胞质cSHMT、线粒体mSHMT 和叶绿体亚型SHMT[5-6]。研究发现，不同植物的基因组中都存在着可能编码质体SHMTs 的基因，同时在典型双子叶植物豌豆（Pisum sativum）和典型单子叶植物大麦（Hordeum vulgare）的叶绿体中也检测到SHMT 活性，说明cSHMT 存在于所有开花植物中[7]。当前，研究较多的是mSHMT 在植物光呼吸过程的作用机理。在植物的线粒体内，参与光呼吸过程中的关键酶是SHMT。当来自于光呼吸的甘氨酸（Gly）进入线粒体中，SHMT 利用线粒体中四氢叶酸的碳将该Gly 转变为丝氨酸（L-Ser），同时与甘氨酸脱羧酶（GDC）配合将2 分子Gly 转变为1 分子L-Ser、1 分子氨（NH3）和1 分子CO2。该反应过程中GDC 和SHMT 紧密协同，促使叶酸及THF 在线粒体中合成，使整个光呼吸过程持续进行（图1）[8-10]。

图1 植物细胞内光呼吸途径示意图

不同植物中3 种构型的SHMT 基因表达及其含量存在差异，同一植物不同器官中亦是如此。研究发现，绿色豌豆叶片线粒体中纯化得到的SHMT 经过离子交换层析柱后可获得2 个不同的峰[11]。拟南芥SHMT 基因最初是用豌豆mSHMT 基因做探针进行筛选的。拟南芥中有7 个SHMT 基因，分别为AtSHM1～AtSHM7。而拟南芥中SHMT 虽然由一个基因家族进行编码, 但SHM1 与SHM2 蛋白产物可能被定位在线粒体基质中，而其他5 个SHMT 基因编码缺乏可识别的定位序列，只能推测可能存在于细胞质中[12]。拟南芥线粒体中SHMl、SHM2 基因mRNA 能够在叶片中积累并受光的强烈诱导，而SHM4 的mRNA 在根中积累且不受光的诱导，推测其在光呼吸中可能不起作用，而是参与根中C1 代谢，SHM4 基因mRNA 在幼苗根中的积累且受生物钟调节[12]。曾广娟等[13]用酶联免疫法（ELISA）和免疫组织化学法（IHC） 对五年生苹果实生树不同节位的SHMT变化进行检测。由此得出结论，在苹果实生树阶段的转变过程中SHMT 表达存在一定差异，SHMT 有且只存在于苹果实生树营养生长期的叶片中，其他生长阶段和部位几乎检测不到其含量。

2 SHMT 基因克隆的进展

在基因功能研究中，正向遗传学的思路通常为首先通过突变表型筛选获得突变体，然后克隆基因，最后研究其功能。尽管目前的突变技术复杂多样，但是常见的突变方法大致有4 种：定向诱变、移码突变、碱基置换突变和自发突变。而目前对于SHMT 基因的研究普遍采取定向诱变，得到所需要的目的DNA 片段，再进一步完成之后的一系列基因克隆工程。基因突变技术日新月异，与之相关的基因克隆技术也呈现出多样化。有的方法周期长，开展难度较大，例如mRNA 差异显示技术、转座子标签技术、基因组减法技术、图谱克隆技术及cDNA 文库筛选技术等，因此在目前的试验研究中运用较少。有的方法试验材料廉价、操作步骤简单、所需时间短，因此应用较多，例如cDNA 末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）。该技术是基于逆转录PCR 从低丰度转录本中快速扩增cDNA 的5'和3'末端的有效手段。该技术方法简单，适用性广，是目前运用较多的基因克隆技术之一。图2 为植物界部分已知SHMT基因家族的蛋白质序列系统进化树。

国外开展SHMT 基因克隆研究较早，1992 年Turner 等[11]就用豌豆的SHMT 基因探针在数据库中筛选出2 个基因（FPGHMT1，FPGHMT2），并用巢式PCR 法扩增其序列。Agrawal 等[14]1995 年用限制性内切酶Nde1 和BamH1 双酶切法从pETSH 中释放出1 452 bp 的羊肝细胞质基因（scSHMT），然后将该基因片段连接到另一个载体pRSET‘C’上，以检测scSHMT 的表达。

林颖辉等[15]采用普通PCR 技术克隆得到2 条坛紫菜的SHMT 全长基因序列，分别将其命名为PhSHMT-1 和PhSHMT-2，在GenBank 中的收录号分别为MF687405 和MF687406。通过多序列比对和系统进化树分析，确认这2 个基因属于SHMT 基因家族。根据介绍，PhSHMT-1 序列全长为1 710 bp，包含了一个有1 491 对碱基的开放阅读框，其编码的多肽包含497 个氨基酸，等电点为4.93，分子量为121.443 kDa；PhSHMT-2 序列全长1 957 bp，其序列也包含有一个开放阅读框，有1 395 对碱基，所编码的多肽包含465 个氨基酸，等电点为4.95，分子量为113.969 kDa。

郭玉朋等[1]对水稻光呼吸突变体mSHMT 基因进行了克隆试验，经互补试验证实水稻线粒体丝氨酸经甲基转移酶基因（osmSHMT）突变，产生了叶绿素缺失表型。试验采用PCR-walking 技术分离了突变体基因组T-DNA 插入位点侧翼序列，比对后发现T-DNA 插入水稻线粒体丝氨酸羟甲基转移酶基因（osmSHMT），经PCR 共分离验证，确定了被标记基因与突变表型共分离，从而初步确定了突变表型可能与T-DNA 插入有关。

3 植物SHMT 家族基因在逆境下的表达研究

植物在生长发育过程中通常需要抵御各种复杂的非生物和生物胁迫，如营养胁迫、重金属胁迫、温湿度胁迫、盐碱胁迫和虫害、病害等。这些胁迫往往同时或接连发生，甚至存在一定的相互作用，直接影响植物的生长发育、分布状况和基因表达等。为了抵御这些胁迫，植物在长期的进化过程中建立了复杂且精细的分子调控网络。一般在遇到胁迫效应时，植物自身的防御机制会被激活，激活的快慢与胁迫程度有较大关系，但不一定是正相关，激活后的防御机制通常伴随着植物激素和部分重要的功能蛋白的参与，例如转录因子、病程相关蛋白、转运蛋白等。而光合作用又是植物最为重要的生理活动之一。因此，研究各种胁迫下植物捕光蛋白基因表达的变化，有重大的研究意义[16]。

图2 部分已克隆SHMT 基因的系统进化树

研究表明，中嗜热链球菌中glyA 基因表达出的SHMT 酶活性大约是大肠杆菌的2 倍，不同的外部条件下，不同生物体中SHMT 基因表达产生的SHMT活性存在较大差异[17]。林颖辉等[15]通过克隆坛紫菜SHMT 基因研究高温胁迫下的SHMT 表达机理，结果显示31℃高温胁迫处理不同时长，PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因的表达模式几乎一致，当31℃高温胁迫处理12 h 时，PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因的表达水平显著上调（P ＜0.05）；而当31℃高温胁迫处理超过12 h 后，表达水平恢复到正常值，极有可能是PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因已经适应了高温的刺激；当31℃高温胁迫处理超过4 d 时，PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因的表达水平又显著上调（P ＜0.05）。这表明高温胁迫时间过长，藻体需要更多的谷胱甘肽以清除活性氧，因此再次激活了植物的防御调控机制。Igamberdiev 等[18]研究发现，丝氨酸（L-Ser）转化为甲酸的途径与形成过程中的磷酸化有关，植物连续的代谢对细胞内氧化还原和能量水平及pH 值的调节有重要影响，尤其是在应激条件下，几种酶的表达参与了生物化学适应环境压力的过程。SHMT 通过甘油酸和磷酸化丝氨酸途径参与调节应激植物细胞的氧化还原平衡，这些途径是连接碳氮代谢和维持细胞氧化还原和能量水平的重要过程。Li 等[19]研究认为，在拟南芥中，GDC/SHMT 和C1-THF/SHMT 途径通常是独立运行的，但当植株受到逆境影响，初级GDC/SHMT 途径受损时，替代的C1-THF/SHMT 途径可以部分弥补丝氨酸合成的不足。Rojas 等[20]在植物与病原菌的相互作用对光呼吸和其他与植物生长所必需的初级代谢影响机理的研究中发现，光呼吸等初级代谢途径参与了植物的防御反应，并认为初级代谢在调节植物防御病原体方面具有较强的相关性。高盐度条件下，盐藻和集胞藻Pcc6803 细胞SHMT 活性的升高提示着SHMT 活性在耐盐过程中发挥了重要作用，表明SHMT 的过度表达增加了蓝藻的耐盐性[21]。以上发现均具有相同结论，即SHMT 基因可能间接参与了植物逆境调节过程或代谢途径弥补过程，其对于植物的逆境生理调节具有重要作用。

4 SHMT 基因家族在植物保护上的应用

当前，人们对粮食和农副产品数量和质量的要求日益提高，我国农业正处于量变带动质变的新阶段。每年因为植株自身或者外界因素而导致的粮食损失巨大。不管是从保护粮食解决世界人口温饱的角度，还是从保护生态圈平衡的角度，研究并实现多手段的植保技术是需要长期关注的课题。以SHMT 基因为例，其作用的靶标在植物体内是极其关键的。有研究指出，SHMT 严重减少的转基因马铃薯叶片中Gly 的水平比野生型高100 倍，光合作用速率降低，因此光合作用速率与Gly 水平呈负相关，与SHMT 活性呈正相关。在高光照条件下SHMT 活性降低对植物生长的负面影响十分显著。有研究认为，当缺乏SHMT 时，植物会表现出生长延迟和叶片萎黄，因而SHMT 可以作为除草剂作用的新对象，通过降低SHMT 含量达到除草的目的[6]。通常认为植株加强能量是通过光呼吸促进卡尔文循环，以避免光合电子传递链被过度还原，而光呼吸功能的减弱会导致电子在PSI 端被氧分子融合产生超氧阴离子，还伴随着过氧化氢的生成，这些活性氧如不能被及时清除，将产生光氧化，进而影响植株生长[22]。

SHMT 功能的变化也会通过影响光呼吸作用而影响植物生理过程。例如光呼吸能调控多种信号传递途径，其中激素响应途径是控制植物生长发育的关键，而这一途径需要依赖SHMT 的参与。除细胞氧化还原状态会影响激素信号传递途径外，在已发现的植物激素中，赤霉素、脱落酸等合成的部分反应在叶绿体内进行，而SHMT 在叶绿体中参与的氧化还原反应产生的氧气和磷类物质可能是影响这些植物激素合成的因素[23-24]。目前，利用植物SHMT 靶标及其生理机能进行植物保护的实际应用研究较少。

5 结论与展望

目前，关于植物SHMT 基因家族的研究已经有较多进展。例如SHMT 基因的命名与分类、SHMT 基因家族的主要结构与演变和进化、SHMT 基因的主要功能。可是在植物SHMT 基因克隆及逆境表达方面的研究涉及的植物种类较少，应用于植物栽培及抗逆、抗病虫害等方面的研究也缺乏，但随着植物SHMT 性质的进一步被研究阐明，利用SHMT 的某一特殊生理功能促进植物栽培种植及保护的技术必将与高效的基因工程技术一样广泛应用于生产。