6 种野生观赏蕨无菌培养体系的建立

秦 波，林 茂，黄 欣，孙开道，李 冰，唐 庆，王华新，李进华

（广西壮族自治区林业科学研究院，广西 南宁 530002）

观赏蕨有“无花之美”之称，其以飘逸优美的株型、翠绿精致的叶片吸人眼球，既可露地栽植用于园林绿化美化，又可做成盆栽商品或通过简单加工做成切叶产品，是观叶植物产业的重要组成部分[1-2]。中国蕨类资源丰富，达2 600 种以上，约占全世界的21.67%，但尚未得到有效的开发和利用[3]。据研究报道，当前我国的商品观赏蕨类品种单一，来源主要依靠野外采挖和国外进口。野外采挖及国外进口不仅生产成本高，而且不利于产业的长久持续发展。造成当前局面的原因主要是国内观赏蕨的繁殖技术不成熟，难以满足产业发展要求[4]。

露地栽植蕨类一般采用孢子繁殖和分株繁殖。孢子繁殖具有繁殖系数高、孢子易获得的优势，但容易受外界环境因子影响；分株繁殖的繁殖系数较低，且同样易受外界环境的影响[5]。无菌培养是一种快速有效的繁殖技术，且不受外界环境、季节等的影响，能满足观赏蕨规模化生产的需求[6]。

毛柄双盖蕨（Diplazium dilatatum）、狗脊蕨（Woodwardia japonica）、蜈蚣草（Eremochloa ciliaris）、林下 凸轴蕨（Metathelypteris hattori）、刺头复叶耳蕨（Arachniodes aristata）和扇叶铁线蕨（Adiantum flabellulatum）均为广西野生观赏蕨，其中毛柄双盖蕨、狗脊蕨为大型观赏蕨，蜈蚣草、林下凸轴蕨、刺头复叶耳蕨为中型观赏蕨，扇叶铁线蕨为小型观赏蕨。除蜈蚣草和扇叶铁线蕨外，鲜见其余4种观赏蕨有组培快繁的报道。因此，笔者探讨了不同消毒时间对这6 种观赏蕨孢子萌发和污染率的影响，以期为其无菌培养及规模化生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 孢子采集

1.1.1 采集地点 毛柄双盖蕨、狗脊蕨、刺头复叶耳蕨的孢子采集于广西桂林市灵川县，蜈蚣草、扇叶铁线蕨、林下凸轴蕨的孢子采集于广西南宁市西乡塘区。

1.1.2 采集方法 将具有成熟孢子的完整叶片剪下，放入洁净、密封的纸袋内带回实验室，置于干燥、通风处。6～7 d 后待孢子自然散落时，将孢子收集于小号纸袋中，立即用于接种试验或用装有变色硅胶的广口瓶密封置于4℃冰箱保存。

1.2 孢子消毒

称取5 mg孢子置于2 mL离心管中 （每种蕨6管），加入适量蒸馏水，充分震荡后浸泡4 h。用移液枪将蒸馏水吸出后加入0.1% HgCl2分别处理2、4 和6 min（每处理2 管），然后用无菌蒸馏水漂洗4～5 次，最后加入适量无菌蒸馏水配置成孢子悬浊液。

1.3 接种及培养

接种培养基为MS 培养基，pH 值5.8，琼脂浓度为 6.0 g/L，每瓶接种约1 mL 孢子悬浮液，每处理10瓶，设重复3 次。培养条件为温度25℃，光照1 200～ 1 600 lx，光照周期12 h/d。

1.4 数据统计及处理

接种2 d 后开始定期观察，记录不同处理的孢子污染率、萌发率、第一个孢子萌发的时间、第一株孢子体出现的时间。统计截止到接种后180 d。

污染率（%）=（污染瓶数/接种瓶数）×100

萌发率（%）=（萌发瓶数/未污染瓶数）×100

采用Excel 2010、SPSS 22.0 进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时长对孢子污染和萌发的影响

如表1 所示，毛柄双盖蕨孢子不同消毒时长处理的污染率均低于10%，且随着消毒时长的增加污染率呈下降趋势，但3 个处理间无显著差异；孢子萌发率随着消毒时长的增加逐渐下降，2 min 处理的萌发率为28.52%，显著高于4 min 处理（6.67%）和6 min 处理（0%）。蜈蚣草孢子的污染率随着消毒时长的增加逐渐下降，2 和4 min 处理的孢子污染率分别为31.52%和23.33%，这2 个处理间无显著差异，但显著高于6 min 处理的（6.67%）；孢子萌发率随着消毒时长的增加显著下降，2 min 处理的萌发率最高（91.67%），显著高于4 min 处理（9.52%）和6 min 处理（0%）。扇叶铁线蕨孢子的污染率随着消毒时长增加呈下降趋势，4 和6 min 处理的污染率分别为10.00%和6.36%，这2 个处理间无显著差异，但显著低于2 min 处理的（22.73%）；孢子萌发率随着消毒时长的增加呈显著下降，2 min 处理的萌发率最高（100.00%），显著高于4 min 处理（37.31%）和6 min 处理（3.33%）。林下凸轴蕨的孢子污染率随着消毒时长增加呈下降趋势，但3 个处理间无显著差异；孢子萌发率随着消毒时长的增加也呈下降趋势，2 min处理的萌发率最高（79.96%），显著高于4 min 处理（38.15%）和6 min 处理的（7.41%）。狗脊蕨孢子的污染率随着消毒时长的增加呈显著下降趋势，6 min处理的污染率最低（10.37%），显著低于4 min 处理（30.00%）和2 min 处理的（60.74%）；孢子萌发率随着消毒时长增加也呈下降趋势，2 min 处理的萌发率最高（66.67%），显著高于4 min 处理（4.76%）和6 min 处理（8.33%）。刺头复叶耳蕨的孢子污染率随着消毒时间增加呈下降趋势，但3 个处理间无显著差异；孢子萌发率随着消毒时长增加也呈下降趋势，2 和4 min 处理的萌发率分别为24.07%和21.48%，这2 个处理间无显著差异，但显著高于6 min 处理的（0%）。

综合孢子污染率和萌发率分析，毛柄双盖蕨、蜈蚣草、扇叶铁线蕨、林下凸轴蕨、狗脊蕨孢子采用0.1% HgCl2消毒的最佳消毒时长为2 min，刺头复叶耳蕨采用0.1% HgCl2消毒的最佳消毒时长为2 或4 min。

表1 不同消毒时长处理的孢子污染和萌发情况

2.2 第一孢子萌发和第一株孢子体出现所需培养时间

由表2 可看出，蜈蚣草第一个孢子萌发所需培养时间最短，仅需6 d，随后依次是扇叶铁线蕨、林下凸轴蕨、狗脊蕨和毛柄双盖蕨，萌发所需培养时间最长的为刺头复叶耳蕨，需107 d。蜈蚣草第一株孢子体出现所需培养时间最短，为65 d，随后依次是林下凸轴蕨、狗脊蕨、扇叶铁线蕨、刺头复叶耳蕨，所需培养时间最长的为毛柄双盖蕨，达178 d。除蜈蚣草孢子体出现所需培养时间低于100 d 外，其余5 种均超过130 d。

3 结论与讨论

外植体消毒是建立组织培养无菌体系的首要步骤，因为消毒的效果直接影响后续的培养。蕨类植物孢子消毒方式主要包括：用滤纸将孢子或孢子囊包起消毒、用布将孢子包好消毒和将孢子放入离心管中消毒，常用的消毒药剂包括0.1% HgCl2、5%次氯酸钠、70%～75%酒精等，消毒时间一般为2～10 min[7-9]。该试验采用将孢子放入离心管中消毒的方式，选用0.1% HgCl2作为消毒药剂，设置2、4 和6 min 3 个消毒时长处理，对6 种蕨类孢子的消毒试验结果表明，除刺头复叶耳蕨的最佳消毒时长为2 或4 min 外，其余5种蕨类的最佳消毒时长均为2 min。孢子萌发率最高的为扇叶铁线蕨，达100%，其他5 种蕨从高到低依次是蜈蚣草（91.67%）、林下凸轴蕨（79.96%）、狗脊蕨（66.67%）、毛柄双盖蕨（28.52%）和刺头复叶耳蕨（24.07%）。

表2 第一个孢子萌发和第一株孢子体出现所需培养时间

孢子萌发一般采用MS 为基本培养基，但有研究表明蔗糖和无机盐在蕨类孢子萌发前期的主要作用是作渗透压的调节剂，因而较低浓度的无机盐和蔗糖浓度有利于孢子从外界吸收水分而开始萌发[4,10-12]。该试验以MS 为萌发培养基，6 种蕨的孢子均能萌发，但其中狗脊蕨、毛柄双盖蕨、刺头复叶耳蕨的第一个孢子萌发所需培养时间较长，均超过60 d。孢子萌发所需培养时间与蕨的种类相关，但同时也受萌发培养基和预处理的影响。因此后续研究可通过调整培养基的无机盐和糖分浓度以及采用不同预处理手段如赤霉素处理、温水浸泡等处理孢子以探讨如何缩短孢子萌发所需培养时间。