红冠桉种子外植体组培体系的建立

刘欣，黄振，陈炙，李佳蔓，郭洪英

红冠桉种子外植体组培体系的建立

刘欣，黄振，陈炙，李佳蔓，郭洪英

(四川省林业科学研究院，四川 成都 610081)

红冠桉是重要的观赏性桉树，种苗供应不足是限制其发展的瓶颈所在。本研究以红冠桉种子为外植体，研究萌发、增殖、生根技术，结果表明：红冠桉种子萌发的最佳培养基为改良MS+0.5 mg·L6-BA+0.2 mg·LIBA+30 g·L蔗糖+6 g·L琼脂，种子萌发率达68.86%；最佳的增殖培养基为1/2改良MS+0.3 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA+30 g·L蔗糖+6 g·L琼脂，接种后，首先暗培养7 d，然后转入光照强度3 000 lx的LED灯下，每日光照10 h，增殖系数4 ~ 6；最佳的生根培养基为1/2改良MS+0.2 mg·LNAA+0.1 mg·LIBA+15 g·L蔗糖+6 g·L琼脂，生根率77.5%。

红冠桉；种子；增殖；生根

桉树是桃金娘科(Myrtaceae)桉属()、杯果木属()和伞房属()树种的统称，共有808个种和137个亚种或变种，其中观赏价值较高的树种有100多种。与其他观赏植物相比，观赏桉树具有易管理、抗病抗虫能力强等优点，广泛应用于庭院及公园栽培、街道绿化等，红冠桉()是其中有代表性的红花类型红冠桉为桃金娘科桉属中等乔木，树干灰白色，高8 ~ 10 m，自然分布在澳大利亚西部和北部，喜温湿环境，是开花桉树中很漂亮的品种之一，原产地花期集中在每年9月到次年3月，大型头状花序显著高出叶面，花序直径可达7 cm，盛花期蔚为壮观。红冠桉已在广东、福建和海南等地引种。其苗木主要来源于实生苗，种子完全依赖进口严重制约了红冠桉的应用。

2019年，课题组从澳大利亚引种了一批红冠桉种子，播种发现萌发率不足50%，显微观察发现部分未萌发种子形态正常、种子结构完整，表明种子内可能存在某些抑制种胚萌发的物质。本研究拟通过组织培养的方法，打破种子休眠，提高种子萌发率，建立红冠桉组培再生技术体系，以期获得尽可能多的红冠桉无性系，为下一步红冠桉在四川的引种驯化奠定材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验材料为2019年从澳大利亚引进的红冠桉种子。取外观饱满、无病虫害的种子，先用流水冲刷30 s去掉杂质和漂浮物，沥干水分后转入超净工作台备用。依次用75%酒精浸泡30 s、0.1%氯化汞浸泡3 min，无菌水洗4 ~ 5次后备用。

1.2 萌发培养基筛选

以改良MS为基本培养基，将消毒后的种子接入初代培养基(表1)，每瓶接种1粒，7 d后去掉污染瓶。25 d后统计种子萌发数，每个处理随机挑选30瓶，3次重复，10瓶·重复。

1.3 增殖培养基筛选

萌发的苗长至2 ~ 3 cm时，剪去子叶和根，剪成带有1 ~ 2个腋芽的茎段，接种到增殖培养基(表2)，每瓶接种2个。培养条件：温度27℃，光照3 000 lx。30 d后观察记录茎段的生长状态。

1.4 生境对增殖效率的影响

以1.3获得最佳增殖培养基为CK，以光照时间和灯源为因素(表3)，比较不同培养环境对腋芽诱导的影响。每处理随机选择30个芽苗，分别统计每株芽苗上新生的腋芽对数量，每个处理的平均每株腋芽对数量即为平均增殖系数。

1.5 生根诱导培养基筛选

选取长2 ~ 3 cm，节间均匀，叶片完全展开的带顶的芽接种到生根培养基(表4)，每瓶接种10株，每个处理40瓶，4次重复，10瓶·重复。培养条件：温度25℃，光照4 000 lx。20 d后统计生根率及芽苗生长状态。将红冠桉生根苗放置在4 000 ~ 5 000 lx的光照，25℃温度下培养7 ~ 10 d后，将其移至大棚进行炼苗。在大棚逐渐增强光照，使苗木更好地适应外部环境。当生根苗基部长出3 ~ 5条根，根长2 ~ 3 cm时，可出瓶移栽。移栽基质为椰糠、珍珠岩、细泥炭(V：V：V=1：1：2)。

1.6 培养条件

培养基pH为5.8 ~ 6.2，琼脂6 g·L；诱导和增殖培养基蔗糖浓度为30 g·L，生根培养基蔗糖浓度为15 g·L。

1.7 数据统计与分析

种子平均萌发率和平均增殖系数在DPS16.05中进行数据处理和分析，百分数反正弦平方根转换后用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 种子萌发培养基筛选

由表1可知，CK中的发芽率与自然播种的发芽率类似，均低于50%。添加了激素后，红冠桉种子在含有激素的培养基中的发芽率均显著高于CK，但处理间差异显著。其中处理3中的种子平均萌发率显著高于其他处理，而在增加了6-BA浓度后(处理1)，种子萌发率反而下降，具体表现有部分种子膨大，长出的子叶畸形有褶皱，表明高浓度的6-BA对种子形态造成了影响。而把IBA更换为NAA后(处理2、4、5)，各处理的部分种子出现了愈伤化迹象，少数种子诱导出愈伤组织后死亡，因此，在种子萌发阶段，培养基中不宜出现NAA。

当培养基中含有GA时(处理6、7)，与CK相比，能显著提高种子萌发率，但效果没有是生长素和分裂素组合的效果好。

综上所述，优选处理3为红冠桉种子萌发最佳诱导培养基。

2.2 增殖培养基筛选

继代培养发现，幼苗茎段在处理3中继续培养1 ~ 2代后极易出现玻璃化，节间缩短及黄化的问题，增殖倍数不足1.5倍，因此，当幼苗萌发后，则需要更换增殖培养基。

由图1可知，处理A、G中增殖苗不能正常生长，腋芽位压缩，茎段无法正常伸长，并且伴有轻微玻璃化；处理B、H中增殖苗出现明显玻璃化，腋芽位压缩，茎段无法正常伸长；处理C、I增殖苗叶片出现明显黄化，叶和芽的生长受到明显抑制，苗子生长缓慢；处理D、J增殖苗腋芽正常生长，叶片正常展开，叶呈长矛型；处理E、K增殖苗叶、芽、茎均受到抑制，叶黄化，根的生长得到促进作用，有的开始出现根的分化；处理F、L增殖苗的芽受到严重抑制，弱小的增殖苗出现明显的枯死现象。因此，从增殖效果来看，处理J是红冠桉茎段最佳增殖培养基。

表2结果表明，在基础培养基和NAA浓度相同的情况下，6-BA在0.3 mg·L时达到最佳浓度；6-BA达到0.5 mg·L时，组培苗出现玻璃化，可能是高浓度的细胞分裂素诱导乙烯的合成和积累，但6-BA浓度降低至0.1 mg·L时，茎段生长缓慢；在基础培养基和6-BA浓度相同的情况下，低浓度NAA(0.1 mg·L)中的茎段生长情况均好于高浓度NAA(0.2 mg·L)中的茎段，高浓度NAA中的茎段腋芽位受抑制；在NAA和6-BA均相同时，1/2改良MS培养基均好于MS改良培养基，具体表现为：叶子展开程度更大，茎段生长更快，芽生长更好。

综上可知，红冠桉茎段最佳增殖培养基为1/2改良MS+0.3 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA。增殖倍数为4 ~ 6。

表1 红冠桉种子萌发培养基筛选

注：相同字母表示>0.05。

图1 红冠桉增殖培养基筛选

2.3 不同培养方式对继代增殖的影响

常规生根管理的红冠桉平均增殖系数为3.67，改用相同光照强度的LED灯后，处理1中的新生腋芽萌发率提高了，但12 h的光照时间后，顶芽和部分新生腋芽焦枯或者容易发黄，推测原因是LED能量高于日光灯，12 h的光照对红冠桉组培苗有灼伤作用。当LED等光照时间降低至10 h时，显著提高了增殖系数。处理3在茎段接种后，增加了7 d的暗培养，导致茎段在这段时间出现了徒长，有利于拉长节间距离，在转为光照培养后，芽苗1 d后完成了转绿，且增殖系数最高，同时，芽苗高了后，也大大降低了生根材料接种的难度，从而显著提高了生产效率。因此，在红冠桉的组织培养生产过程中，需要根据增殖苗的生长状态，进行一定时间的避光处理，来提高生产效率。

表2 红冠桉增殖培养基筛选

表3 红冠桉增殖培养环境筛选

图2 红冠桉增殖苗与生根苗特性

注：A为增殖处理3；B为生根处理2。

2.4 生根培养基筛选

芽苗接入生根培养基10 d后基部开始出现根点，20 d后基本生根完成，根长2 ~ 3 cm，以处理2的生根率最高(表4)，提高NAA浓度，芽苗基部容易产生愈伤组织，提高IBA浓度，反而抑制了根的生长。移栽苗长势见图3。

表4 红冠桉组培苗生根培养基筛选

图3 红冠桉组培苗移栽

3 结论与讨论

桉树的组织培养，常使用经过子代测定或者选优的优树萌芽材料做为外植体，以期保留优树的遗传增益，而种子常因为遗传分化导致其表现与母本有差异，因此，种子外植体一般不用于以用材为目的的桉树组培，而观赏桉树则需要获得尽可能多的变异植株，为开发观赏型桉树新品种创造条件。

组织培养的关键是获得合适的外植体。种子作为稳定的幼嫩材料，常作为外植体，用于制备无菌苗和胚性愈伤组织。本研究在原有种子萌发试验基础上，把种子作为外植体放入含有激素的培养基上培养，获得了比常规GA打破休眠更好的萌发效果。

芽苗增殖中发现，在温度27℃、光照3 000 lx LED环境中培养，当6-BA浓度达到0.5 mg·L时，均容易出现玻璃化；当NAA浓度达到0.2 mg·L时，会出现玻璃化，腋芽位压缩及黄化甚至枯死，因此，生长调节剂浓度超过范围则影响组培苗的生长，研究表明，高浓度的6-BA会诱导乙烯合成，最终导致玻璃化。这与高丽琼等和杨艳等研究的增殖苗的6-BA和NAA最佳使用浓度有所不同，可能是因为选择的外植体材料不同，本研究选择的是种子，红冠桉种子作为外植体材料进行组织培养在同等的6-BA和NAA浓度下能够达到更好的增殖效果和增殖倍数，从而导致本研究中的增殖苗在增殖过程中，外源激素浓度不能过高使用，6-BA和NAA浓度过高反而抑制了增殖苗的生长。本研究在较低浓度外源激素下进行增殖培养，获得了较高的增殖倍数，增殖倍数达到4 ~ 6倍。并将其中生长的增殖苗转移到了生根培养基中生根，发现在较低激素浓度时，NAA为0.2 mg·L、IBA为0.05 mg·L，就能达到较高的生根率，生根率最高达78.7%，这与高丽琼等和杨艳等红冠桉生根的结果有差异。

本研究以引种的红冠桉种子为材料，建立了红冠桉植株再生技术体系，诱导获得了一批无性系组培苗，下一步课题组将扩大无性系群体，为建立红冠桉无性系测定林奠定材料基础。

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Establishment of Tissue Culture Systems forSeed

LIU Xin, HUANG Zhen, CHEN Zhi, LI Jiaman, GUO Hongying

()

is an important ornamental species of, but a shortage of seed is a bottleneck that restricts the species’ domestication and development. In this study,seeds were used as explants to study germination, shoot proliferation and rooting in tissue culture. The experimental results showed that the best media for the germination of seeds was modified MS + 0.5 mg·L6-BA + 0.2 mg·LIBA + 30 g·Lsucrose + 6 g·Lagar, and this provided a seed germination rate of 68.9%. The best media for shoot multiplication was 1/2 modified MS + 0.3 mg·L6-BA + 0.1 mg·LNAA + 30 g·Lsucrose + 6 g·Lagar. After inoculation, culturing in the dark for 7 days and then transferring to a place with 3 000 lx LED light for 10 hours a day provided a proliferation coefficient of 4 ~ 6. The best media for rooting proved to be 1/2 modified MS + 0.2 mg·LNAA + 0.1 mg·LIBA + 15 g·Lsucrose + 6 g·Lagar, which provided a rooting rate of 77.5%.

; seed; proliferation; rooting

S722.3+7

A

10.13987/j.cnki.askj.2021.01.009

四川省科技计划项目(2020ZHYZ0008)；四川省省财政专项项目(2020CZZX18)

刘欣(1997— )，女，本科，研究实习员，主要从事组织培养研究，E-mail:2889792053@qq.com

陈炙(1977— )，男，本科，高级工程师，主要从事林木遗传育种研究