大量元素对桉树组培生根的影响

王楚彪，李华强，樊林华，何文亮，罗建中，卢万鸿，林彦

大量元素对桉树组培生根的影响

王楚彪，李华强，樊林华，何文亮，罗建中，卢万鸿，林彦

(1. 国家林业和草原局桉树研究开发中心，广东 湛江524022；2. 南京林业大学，江苏 南京210037；3. 中林集团雷州林业局有限公司, 广东 湛江524043)

选用大面积种植的桉树优良无性系尾巨桉DH32-29的环割嫩芽为外植体，采用正交试验设计进行组培生根实验，探讨不同大量元素对桉树组培生根的影响。结果表明：(1)硝酸钾对根条数、根长、茎高起到主效应作用，高浓度硝酸钾在675 mg·L促进根条数的诱导，却抑制根的生长，硝酸钾浓度在405 mg·L达到茎高顶峰值；(2)既适合根诱导又保证根、茎质量的培养基中大量元素组合为硝酸钾、磷酸二氢钾、硝酸钙、氯化钙、硫酸镁对应浓度分别为405、862.5、390、200、700 mg·L；(3)最适合根诱导的培养基中大量元素硝酸钾、磷酸二氢钾、硝酸钙、氯化钙、硫酸镁对应浓度分别为675、345、390、120、280 mg·L；最适合根生长的大量元素浓度分别为270、862.5、260、200、700 mg·L；最适合茎生长的大量元素浓度分别为405、345、650、200、420 mg·L。研究结果有助于更清楚地认识大量元素对桉树组培生根的影响，有助于提高桉树组培的生根效果。

桉树；组织培养；大量元素；正交设计

桉树()是华南地区最主要的商品林树种，在华南地区林业中占重要的地位。桉树杂交种是利用不同品种桉树作为亲本，通过人工控制授粉培育而成。桉树引种和推广种植需要大量的杂交无性系，因此需要对杂交桉子代进行无性扩繁。无性繁殖包括组织培养，桉树的芽培养是迄今为止应用最普遍的培养方法，桉树组培既能规模化生产，又能够保持亲本的优良特性。尾巨桉()DH32-29是广西东门林场以尾叶桉U16()为母本、巨桉G46()为父本杂交的优势种，后经无性繁殖得到的优良桉树品种。该无性系具有生长迅速、产量高、抗病性强、干行通直圆满、自然整枝好等优点，在各地的种植试验均表现出较强的适应性和良好的速生丰产性能。

前人对桉树组培生根已经做过大量研究，大多数对生根培养基的处理是设立等梯度的植物生长调剂浓度，卢开成得出尾巨桉DH32-26最佳生根培养基是改良1/2 MS + IBA 0.2 mg·L+ ABT0.3 mg·L。杨卫星得出尾巨桉DH32-28最佳生根培养基是1/2 MS + IBA 0.3 mg·L+ ABT0.6 mg·L。然而卢娟等得出尾巨桉DH32-29最佳生根培养基是MS+NAA 1mg·L+ 6-BA 0.2 mg·L。梁秀莉以改良1/2 MS为基本培养基，对3个无性系DH32-26、DH32-28、DH32-29进行离体快繁研究，得出尾巨桉DH32-26最佳诱导生根植物生长调节剂组合为IBA 0.2 mg·L+ABT1.5 mg·L，DH32-28、DH32-29最佳诱导生根植物生长调节剂组合为IBA 0.2 mg·L+ ABT1 mg·L。尽管用的是相同的试验材料，但得出结果却不尽相同。而大量元素对尾巨桉生根的影响程度却鲜有研究。陈明渊对尾巨桉DH33-27组培生根设立不等梯度浓度的大量元素进行单因素分析，得出大量元素浓度为1/2MS时，生根效果较好。大多数人在桉树组培生根培养阶段都使用1/2 MS或1/4 MS为基本培养基，因此本试验基于1/2 MS培养基进行优化。

为了提高桉树组培苗的质量，需要进行组培配方的试验，而其中组培生根试验是重要环节，在这一方面，用以往的常规MS培养基达不到高效的生产要求，为了进一步改良桉树的培养基，本研究以尾巨桉DH32-29为对象，对所使用的生根培养基进行改良，以期提高桉树组培生根的质量和效率。

1 材料与方法

1.1 材料

以广西东门林场的优良无性系单株尾巨桉DH32-29经环割后萌发的枝条作为外植体，经过初代培养以及继代增殖培养获取大量增殖材料。

1.2 正交试验因素水平的确定

传统常规MS培养基中含有NH4成分，但是NH4浓度越高，就越抑制根的生长，浓度在0.3 g·L时苗木生长正常，NH4在生产应用过程中存在一些问题，生根周期间部分苗株的根系质量低、根系少，且一直不抽高，呈现淡黄色，此现象在夏季高温天气更严重。因此，本试验用硝酸钙代替硝酸铵。本研究采用正交设计对生根培养基的大量元素进行分析，以往的生根培养基的配制，仅调控总体大量元素的浓度，使用不等梯度100%、50%、40%、30%MS培养基进行试验，而无法分析各个元素的主效应。通过正交试验设计可得出各个元素的主效应，得到不同因素水平的最优组合，从而确定合理的试验方案。分析生根率、根长、苗长三个指标，确定这3个指标受到哪种元素以及水平的影响，从而选择出生产上所需要的方案。

在生产上使用的1/2 MS处理的基础上，选择不同浓度的硝酸钾、磷酸二氢钾、硝酸钙、氯化钙、硫酸镁为考察因素，以根条数、最长根根长、茎高为考察指标，按L(4)进行正交试验，16个处理因素水平安排见表1。

表1 正交因素水平表 mg·L-1

1.3 生根培养

待增殖芽苗长至2 cm以上时，切取带顶芽茎段作为生根芽，接入正交设计的生根培养基中，每个处理重复30瓶，每瓶接10个芽。每个处理固定加入相同的植物生长调节剂、蔗糖等，置于温室自然条件下进行培养。30 d后观察生根情况，记录根条数、根长、径高3个生长指标。

1.4 数据统计

采用SPSS 19.0统计分析软件对数据进行方差分析与显著性分析。其中极差计算见公式1，生根率公式见公式2。

=K−K(1)

式中：K=同一列因素中水平的均值总和/水平的个数。

生根率=(根条数/接种个数)×100% (2)

2 结果与分析

2.1 生根实验苗生长状况

16组处理中，共512个苗瓶，生根率为30%的有161瓶，生根率大于50%的有26瓶；对照组生根率均值为29.0%，处理13生根率最大值为40.7%；处理4、6、7、11出现掉叶的现象；处理15试验号生根条数离散程度较大、生根率不稳定。处理4根长均值最大，该处理根长最大值为5.5 cm，最小值为1.5 cm，同时离散程度较大。处理9茎高均值最大，该处理茎高最大值为4.6 cm，最小值为1.7 cm，同时离散程度较大(表2)。

表2 大量元素对组培生根的的正交实验结果

注：不相同大写字母表示<0.01；不相同小写字母表示<0.05。

2.2 各处理对桉树组培生根的影响分析

基于17(包括对照CK)个处理对根条数、根长、茎高进行单因素多重比较，不同培养基处理的根条数、根长、茎高存在显著差异，根条数最高的为处理13(ABCDE)，与其他处理差异极显著，根条数最低的为处理4(ABCDE)，同样与其他处理差异极显著，根条数对照处理与处理3、7、9、10、11差异达不到极显著；根长最长的为处理4(ABCDE)，与处理6(ABCDE)无显著性差异，根长对照组与其他处理差异极显著；茎高最高的为处理9(ABCDE)，极显著高于其他组合，茎高对照组与处理3、14差异极不显著。

2.3 大量元素对桉树组培生根的主效应分析

由极差分析可得(表2)，大量元素对尾巨桉DH32-29组培生根的根条数的影响顺序为硝酸钾>硝酸钙>氯化钙>磷酸二氢钾>硫酸镁。对应的K值显示，根条数最优组合是ABCDE，即硝酸钾、磷酸二氢钾、硝酸钙、氯化钙、硫酸镁浓度分别对应675、345、390、120、280 mg·L，此时生根条数最多。对同一因素不同水平进行两两比较，得出根条数所需的磷酸二氢钾与硫酸镁分别在各自的4个水平上表现差异不显著，这表明，即使在最优组合下，也可以选择B、E药品的4个浓度。

大量元素对尾巨桉DH32-29组培生根根长的影响顺序为硝酸钾>磷酸二氢钾>硝酸钙>硫酸镁>氯化钙。根长最优组合是ABCDE，即硝酸钾、磷酸二氢钾、硝酸钙、氯化钙、硫酸镁浓度分别对应270、862.5、260、200、700 mg·L，此组合有助于根的生长，在最优组合的基础上，根长的硝酸钾K、K差异不显著，硫酸镁在K、K、K水平上差异不显著，可选择A、E、E、E进行组合。

大量元素对尾巨桉DH32-29组培茎高生长的影响顺序为硝酸钙>硝酸钾>氯化钙>硫酸镁>磷酸二氢钾，即硝酸钙起主要作用。茎高最优组合是ABCDE，即硝酸钾、磷酸二氢钾、硝酸钙、氯化钙、硫酸镁浓度分别对应405、345、650、200、420 mg·L，此组合有助于茎的生长，在最优组合的基础上，可把E替换成E；B替换成B、B、B。

由方差分析可得(表3)，硝酸钾对根条数有显著差异，其他因素对根条数无显著影响。磷酸二氢钾对茎高无显著差异(>0.05)，如考虑节省药品，可选择B、B、B进行组合。根条数与根长各因素主次顺序与极差分析一样，不同的是，茎高因素的硝酸钾大于硝酸钙。

表3 大量元素对组培生根影响的方差分析

通过比较方差均值和生长状况可知，处理13时，根条数达到最大，说明生根率高，但是根长受到了限制，使得根长在这16组处理数据中达到最低值，而浓度越高的硝酸钾越不利于根的生长，却利于生根，综合三个指标，应优先选择A；磷酸二氢钾对生根无显著影响，对根的生长有显著影响，说明高浓度的磷酸二氢钾有利于根的生长，而磷酸二氢钾对苗茎高无显著性差异，应优先选择B；硝酸钙对根长和茎高有显著影响，浓度越高的硝酸钙越有利于茎高的生长，不利于根长的生长，应选择C；氯化钙对根长和茎高有显著影响，且俩者浓度越高都有促进的效应，应优先选择D；硫酸镁对根长有显著性影响，应优先选择E；结合上述分析，生产上要达到生根苗质量标准，应选择ABCDE组合。

3 讨论

3.1 影响生根率的因素

组培生根过程中，影响因素较多，导致生根情况不稳定，例如赤桉()对光照强度敏感，其他桉树树种可正常生长的光照条件，赤桉则表现出不适应性；大花序桉()组培生根则普遍表现困难，在生根性状上，有较多的基因依赖性。本试验尾巨桉DH32-29组培生根率除了受硝酸钾影响可能还受到其他因素的影响，如受到含黄酮类生根抑制剂，或受到铁盐浓度的影响。达到最大的生根率同时避免生根条数的不稳定性是在生产应用中是仍需攻克的问题。此外，由于未对外源植物生长调节剂试验，本试验生根率结果较低。

3.2 硝态氮对组培生根的影响

KNO、Ca(NO)以硝态氮形式利用，浓度越高的KNO对生根率有促进作用，硝酸钾随着水平浓度上升，K值对应增加，但是硝酸钙对根条数无显著差异，在浓度第二水平时K值达到最大；浓度高的硝态氮对根长有抑制作用，硝酸钾与硝酸钙浓度越高，对根长的抑制越明显。梁秀莉表明尾巨桉DH32-29组培生根培养基中KNO浓度越高，生根苗的根系变得越来越短，质量也越低，而且影响根的诱导。硝酸钙浓度在260 ~ 650 mg·L，浓度上升，茎高均值增加；硝酸钾浓度在405mg·L时，茎高达到峰值。高浓度的硝态氮抑制兰科(Orchidaceae)、松科(Pinaceae)组培苗生长，所以在选择硝态氮浓度上，既要提高生根率又要提升生根质量，需要结合指标配比进行试验。

3.3 钙离子对根生长的调节

本试验根长与茎高Ca浓度上升，K值对应增加，但是Ca(NO)浓度上升，根长的K值减小，Ca(NO)浓度为650 mg·L时根长K为2.056，KNO浓度为675 mg·L时，根长K为1.626，说明硝态氮对根长的抑制效应大于Ca促进效应，两者拮抗作用导致根长Ca(NO)的K大于KNO的K。范春节等研究表明不同硝酸钙浓度对尾赤桉()不定芽分化具有一定影响，欧阳磊对邓恩桉()生根培养基中大量元素配比进行优化，降低Cl的含量，提高Ca的含量，以减少愈伤组织的形成。对于桉树生根钙离子调控生长这方面鲜有研究。

3.4 生根培养的大量元素组合优化

对比各处理与大量元素主效应分析，根条数可选择的最优组合ABCDE与根条数最高处理组合13(ABCDE)明显区别是C硝酸钙的选择，硝酸钙对根条数无显著性差异，4个浓度的硝酸钙均对生根根条影响不大。氯化钙对根条数也无显著性差异，证明Ca对生根根条数没有影响，而硝酸钾对生根率有影响。根长可选择的最优组合ABCDE与根长最高处理组合4(ABCDE)明显区别是C硝酸钙的选择，硝酸钙对根长有显著性差异，且低浓度的硝酸钙利于根的质量，证明NO、Ca对生根根长有影响；茎高可选择的最优组合ABCDE与茎高最高处理组合9(ABCDE)明显区别是C硝酸钙与A硝酸钾的选择，证明NO、Ca对茎高有影响。所以正交实验能大大减小试验次数，选择更好的C硝酸钙和A硝酸钾浓度。

本试验中，保证根条数、根长、茎高达到最优情况下，选择ABCE组合不仅节省时间，且能达到生产苗的质量要求，但是生根率低，却浪费了许多试验材料。为了提高生根率，应使用以下步骤生根，即先在生根培养基进行根的诱导，然后转到促根、茎生长的培养基进行营养生长。第一步使用根条数最优组合ABCDE，进行根的诱导，第二步根据苗的生长趋势，选择促根的生长(ABCDE)或者促茎生长(ABCDE)的培养基。

4 结论

桉树组培生根培养基中，高浓度硝态氮影响根的诱导，低浓度硝态氮利于根的质量。硝酸钾在根条数、茎高、根长这三方面起到主效应作用，硝酸钾对根条数有显著差异；硝酸钾、磷酸二氢钾、硝酸钙、氯化钙、硫酸镁对根长有显著差异；硝酸钾、硝酸钙、氯化钙对茎高有显著差异。最适合根的诱导培养基ABCDE，即硝酸钾、磷酸二氢钾、硝酸钙、氯化钙、硫酸镁浓度分别对应675、345、390、120、280 mg·L；最适合根的生长培养为ABCDE，对应浓度分别为270、862.5、260、200、700 mg·L。即适合根诱导又保证根、茎的质量培养基为ABCDE，对应浓度分别为405、862.5、390、200、700 mg·L。

[1] 曾少玲,钟琼和,彭明,等.五个尾叶桉无性系的组培快繁试验初报[J].广东林业科技,2011,27(1):66-70.

[2] 何祖家.巨尾杂交桉组培苗造林初报[J].广西林业,1990(S1):41-47.

[3] 谢耀坚.桉树组织培养研究进展[J].世界林业研究,2000(6):14-19.

[4] 周小华,张伟,黄志萍,等.大花序桉外植体消毒及诱导试验[J].福建林业科技,2018,45(4):47-51.

[5] 庞贞武,沈云,黄全东,等.一种尾巨桉DH32-29品种的组培快繁方法: CN104304027A [P].2015-01-28.

[6] 吴永富,黄永钦,程亮,等.尾巨桉DH32-29无性系在我国南方种植状况调查[J].桉树科技,2012,29(2):24-27.

[7] 卢开成.尾巨桉DH32-26组培快繁技术[J].安徽农业科学,2016,44(14):133-135.

[8] 杨卫星.尾巨桉DH32-28组培快繁技术研究[J].现代农业科技,2018(13):138-139.

[9] 卢娟,吴俊,李铁.巨尾桉DH3229组培育苗技术的初步探究[J].安徽农学通报,2013,19(15):26-28.

[10] 梁秀莉.尾巨桉三个无性系芽器官离体组培快繁技术研究[D].南宁:广西大学,2015.

[11] 陈明渊.尾巨桉组培育苗培养基主要成分研究[J].林业勘察设计,2008(2):70-72.

[12] 周利建,赵艳玲.巨尾桉组培快繁与转基因再生体系的优化[J].广东农业科学,2012,39(22):51-54.

[13] 刘均利,郭洪英,陈炙,等.赤桉组培快繁技术研究[J].桉树科技,2010,27(1):21-26.

[14] 闫慧芳,曾炳山,范春节,等.油菜素内酯对巨桉组培中不定根诱导、苗木生长和茎基部细胞结构的影响[J].广西植物,2016,36(7):763-767.

[15] 韦海,卢思敏,林婧,等.NH4+在桉树组培生根苗中的应用与影响[J].吉林农业,2015(24):57.

[16] 唐再生,王建忠,莫继有,等.大花序桉组培快繁技术及其无性系造林效果的初步评价[J].桉树科技,2018,35(3):36-45.

[17] 黄永利,黄寿先,谭健晖.大花序桉()组培继代苗内源生根抑制物质定性分析[J].广西师范学院学报(自然科学版),2014,31(2):48-51.

[18] 邢文婷,陈彧,许奕,等.新优花卉红冠桉腋芽快繁体系优化[J].分子植物育种,2020,18(15):5106-5114.

[19] 罗剑飘,谭嘉娜,官锦燕,等.不同铵态氮/硝态氮配比对2种开唇兰属植物组培苗生长的影响[J].河南农业科学,2019,48(11):127-140.

[20] 王胤,姚瑞玲.马尾松组培苗对氮素形态的生长响应[J].广西植物,2021.

[21] 范春节,曾炳山,裘珍飞,等.尾赤桉叶片及茎段的离体培养与植株再生[J].福建林学院学报,2009,29(1):74-78.

[22] 欧阳磊.邓恩桉组培生根影响因子的研究[J].福建林学院学报,2006,26(1):78-82.

Effects of Nutrient Elements on Rooting ofin Tissue Culture

WANG Chubiao, LI Huaqiang, FAN Linhua, HE Wenliang, LUO Jianzhong, LU Wanhong, LIN Yan

(1.)

Ring cut buds of×clone DH32-29, an excellent clone planted in large areas, were selected as explants for this research trial. An orthogonal experiment was designed to conduct tissue culture rooting experiments to investigate the effects of various nutrient elements on the of rooting shoots of this clone in tissue culture. The results showed that: (1) potassium nitrate played a major role in the number of roots, root length and stem heigh, with higher concentrations of potassium nitrate promoting the number of roots, but inhibiting the growth of roots at 675 mg·L. The peak value of stem height was reached at 405mg·L. (2) The concentration of key elements in the medium suitable for root induction and ensuring the quality of roots and stems were potassium nitrate 405 mg·L, potassium dihydrogen phosphate 862.5 mg·L, calcium nitrate 390 mg·L, calcium chloride 200 mg·Land magnesium sulfate 700 mg·L. (3) The corresponding concentrations of potassium nitrate, potassium dihydrogen phosphate, calcium nitrate, calcium chloride and magnesium sulfate in the optimal medium for root induction were 675, 345, 390, 120 and 280 mg·L, respectively. The best concentrations of elements for root growth were 270, 862.5, 260, 200 and 700 mg·L, respectively. The most suitable concentrations of elementsfor stem growth were 405, 345, 650, 200 and 420 mg·L, respectively. Results from this study provide a clearer understanding of the effects of key elements on the rooting of tissue culture ofand will help improve the growth of such tissue cultures.

; tissue culture; nutrient elements; orthogonal design

S722.3+7

A

10.13987/j.cnki.askj.2021.01.008

广东省林业科技创新项目(2017KJCX031，2019KJCX014)

王楚彪(1982— )，男，助理研究员，从事林木遗传育种研究，E-mail:scauwcb@163.com

林彦(1977— )，女，高级工程师，从事林木组培研究，E-mail:liny10000@126.com