下调SLC6A3对肾透明细胞癌细胞SNU-349增殖、迁移的影响

王 佳，艾中中，周 菁

1.空军军医大学西京医院泌尿外科，陕西 西安 710000；

2.西安医学院第二附属医院口腔科，陕西 西安 710000；

3.陕西省肿瘤医院肿瘤内科，陕西 西安 710061

肾细胞癌作为常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势，其中80%的组织学亚型为肾透明细胞癌［1］。虽然肾透明细胞癌可以通过手术治疗进行切除，但约有30%的患者在确诊初期已发生转移，即便手术切除，后期也有将近40%的患者会出现转移［2］。因此，探究肾透明细胞癌的发生、发展机制具有重要意义。

溶质载体家族6成员3（solute carrier family 6 member 3，SLC6A3），也被称为DAT1，是一种多巴胺转运蛋白，在多项研究［3-4］中已被证实在肾透明细胞癌患者中表达上调，可以作为生物标志物用于诊断肾透明细胞癌，但SLC6A3对肾透明细胞癌具体的调控机制尚不清楚。本研究探讨SLC6A3对肾透明细胞癌细胞增殖、迁移的影响，并对可能涉及到的分子机制进行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

人肾皮质上皮细胞HK-2及肾透明细胞癌细胞SNU-349购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。DMEM培养基及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司。RNA提取试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒及细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自上海碧云天生物技术有限公司。SLC6A3、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）及磷酸化抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；shSLC6A3（5’-CACCGGGCAAGAAGATCGACTTTCTTTC AAGAGAAGAAAGTCGATCTTCTTGCCC-3’）和shNC（5’-CACCGCTTCACGGTCATCCTCAT CTCGAAAGATGAGGATGACCGTGAAGC-3’）质粒购自苏州吉玛基因股份有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒购自北京欣博盛生物科技有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 组织样本收集

收集2017年1月—2018年1月在陕西省肿瘤医院收治确诊的肾透明细胞癌患者56例，取其手术切除的肾透明细胞癌标本及相应的癌旁组织，置于-80 ℃保存待用。本实验经陕西省肿瘤医院伦理委员会审批通过。

1.3 免疫组织化学法检测SLC6A3蛋白水平

采用10%甲醛溶液固定样本组织，石蜡包埋、切片。然后二甲苯脱蜡、枸缘酸钠修复液修复抗原。冷却后用磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）洗涤，3%过氧化氢室温封闭30 min。SLC6A3抗体4 ℃温育过夜。PBS冲洗后，二抗37 ℃温育1 h。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染，结果由两名经验丰富的医师进行判断［5］，根据细胞染色强度及染色阳性率进行打分。细胞染色强度评分：棕褐色（3分），棕黄色（2分），淡黄色（1分），无色（0分）。染色阳性率评分：无阳性细胞（0分），阳性细胞率≤1 0%（1 分），1 0%＜阳性细胞率≤5 0%（2分），50%＜阳性细胞率≤75%（3分），阳性细胞率＞75%（4分）。按细胞染色强度和染色阳性率综合判断，两者之积≤平均值为低表达组，＞平均值为高表达组。

1.4 细胞培养及转染

HK-2、SNU-349细胞分别接种于含10%FBS的DMEM培养基中，在37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养。将细胞随机分为2组，分别为shNC组和shSLC6A3组，培养24 h后，采用LipofectamineTM3000将构建的shNC和shSLC6A3质粒转染至SNU-349细胞中。转染48 h后，收集细胞进行后续相关实验。

1.5 RTFQ-PCR检测SLC6A3的mRNA表达

采用RNAprep Pure动物组织总RNA提取试剂盒提取肾透明细胞癌组织中的总RNA；采用RNAprep Pure培养细胞总RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA。采用分光光度计分析评估RNA的浓度和纯度。按照说明书，采用FastKing一步法RTFQ-PCR检测SLC6A3 mRNA水平，以GAPDH作为内参。SLC6A3上游引物：5’-CACTCCCGGATGCACTCAAC-3’；下游引物：5’-GATTCCAATCTACGGACGAGC-3’。GAPDH上游引物：5’-CTGACTTCAACAGC GACACC-3’；下游引物：5’-TGCTGTAGCC AAATTCGTTG-3’。采用2-△△Ct计算SLC6A3mRNA的相对表达量，其中△Ct=C tSLC6A3-CtGAPDH。每组设置3个复孔。

1.6 蛋白质印迹法（Western blot）检测SLC6A3、PI3K、Akt蛋白水平

采用RIPA裂解液冰上裂解细胞。12 000 r/min离心20 min收集上清液，获得细胞总蛋白。取50 μg蛋白上样于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）垂直电泳用于分离，运行完毕后采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。室温封闭1 h，SLC6A3和GAPDH抗体4 ℃温育过夜，PBST洗涤，二抗室温下温育1 h。曝光、显影。使用Image J进行定量分析，其中以GAPDH作为内参计算目的蛋白的相对表达水平。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖能力

取适量处于对数生长期的细胞接种于96孔板上，每组设置3个复孔。第2天向每孔加入10 μL的CCK-8试剂，37 ℃避光温育2 h。然后采用酶标仪测定450 nm处的吸光度（D）值。选取的时间点为0、12、24、48 h。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期分布

收集适量处于对数生长期的细胞消化离心收集细胞沉淀，制备细胞悬浮液。细胞凋亡：将细胞与Annexin Ⅴ结合液混合均匀，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液，室温避光温育15 min后，采用流式细胞术检测细胞凋亡。细胞周期：70%乙醇溶液固定细胞30 min，PBS洗涤，收集细胞，加入PI染色液，室温避光温育20 min，PBS洗涤后在流式细胞仪488 nm波长下进行测定。

1.9 Transwell检测细胞迁移能力

收集适量处于对数生长期的细胞，无血清培养基重悬细胞计数，将100 μL 2×104个细胞置于transwell小室上层，下层为500 μL含5%FBS的DMEM培养基。37 ℃温育24 h后，用棉棒刮下膜表面细胞，用0.1%的结晶紫染色液染色20 min。显微镜下观察细胞迁移数目。

1.10 统计学处理

采用Graphpad Prism7.0分析数据。计数资料用%表示，比较采用χ2检验；计量资料用x±s表示，两两比较采用独立t或Mann-WhitneyU非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLC6A3在肾透明细胞癌及细胞中高表达

采用免疫组织化学法分析SLC6A3在肾透明细胞癌及相应癌旁组织中的表达，结果显示，肾透明细胞癌癌组织中SLC6A3的阳性率（67.86%，38/56）显著高于癌旁组织（1 2.5 0%，7/5 6），差异有统计学意义（χ2=35.7，P＜0.05，图1A）；其中肾透明细胞癌癌组织中SLC6A3呈高表达的占25%（14/56）。随后检测SLC6A3在人肾皮质上皮细胞HK-2及肾透明细胞癌细胞SNU-349中的表达，RTFQ-PCR结果显示，与HK-2比较，SNU-349细胞中SLC6A3表达显著上调（1.02±0.04vs4.90±0.17，P＜0.05，图1B）；与此同时，Western blot结果显示，SNU-349细胞内SLC6A3表达显著上调（0.27±0.03vs1.20±0.06，P＜0.05，图1C）。上述结果表明，SLC6A3在肾透明细胞癌组织及细胞中呈高表达。

2.2 下调SLC6A3抑制SNU-349细胞的生长

分别将shNC和shSLC6A3质粒转染至SNU-349细胞中，采用RTFQ-PCR和Western blot进行分析，结果显示，与shNC组比较，shSLC6A3组SLC6A3 mRNA表达（1.00±0.05vs0.37±0.09，P＜0.05，图2A）和蛋白水平（0.83±0.04vs0.12±0.02，P＜0.05，图2B）均显著降低，表明shSLC6A3转染细胞株构建成功。然后采用CCK-8法检测SLC6A3对细胞增殖的影响，结果显示，下调SLC6A3后细胞增殖能力显著降低（48 h：1.50±0.05vs0.94±0.04，P＜0.05，图2C）。

图1 SLC6A3在肾透明细胞癌及细胞中的表达情况Fig.1 SLC6A3 expression in renal clear cell carcinoma and its cells

图2 下调SLC6A3对SNU-349细胞增殖的影响Fig.2 Effects of SLC6A3 downregulation on SNU-349 cell proliferation

2.3 下调SLC6A3促进SNU-349细胞凋亡

采用流式细胞术分析SLC6A3对SNU-349细胞凋亡及周期的影响，结果显示，下调SLC6A3后，癌细胞凋亡比例显著提高（1.70±0.26vs5.70±0.32，P＜0.05，图3A），并将细胞生长阻滞于S期（26.70±0.87vs37.30±0.61，P＜0.05，图3B）。

2.4 下调SLC6A3抑制SNU-349细胞迁移

采用transwell实验检测SLC6A3对SNU-349细胞迁移能力的影响，结果显示，下调SLC6A3后，细胞迁移能力显著降低（80.3±6.1vs20.7±3.2，P＜0.05，图4）。

2.5 SLC6A3通过调控PI3K/Akt信号通路影响SNU-349细胞的生长

采用Western blot检测发现，下调SLC6A3后细胞内PI3K（0.73±0.04vs0.21±0.03，P＜0.05）及Akt磷酸化（1.10±0.09vs0.14±0.02，P＜0.05）水平显著降低（图5A）。进一步采用CCK-8法检测，结果显示，与shSLC6A3组比较，shSLC6A3+740 Y-P（PI3K激动剂）组细胞活力显著升高（48 h：0.95±0.04vs1.40±0.02，P＜0.05，图5B）。上述结果表明，SLC6A3通过调控PI3K/Akt信号通路影响SNU-349细胞的生长。

图3 下调SLC6A3对SNU-349细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of SLC6A3 downregulation on SNU-349 cell apoptosis

图4 下调SLC6A3对SNU-349细胞迁移能力的影响Fig.4 Effects of SLC6A3 downregulation on SNU-349 cell migration ability

图5 SLC6A3通过调控PI3K/Akt信号通路影响SNU-349细胞的生长Fig.5 SLC6A3 affected the growth of SNU-349 cells by regulating the PI3K/Akt signaling pathway

3 讨 论

肾透明细胞癌是最致命的泌尿生殖系统癌症。据统计全球每年大约新增40万确诊病例及14万死亡病例，手术切除是目前主要的治疗方式，但是后期容易发生癌细胞转移［6］。因此，探究肾透明细胞癌的增殖、迁移机制具有重要意义。

SLC6A3作为一种转运蛋白，在机体内负责调节大脑中多巴胺的浓度，其表达异常与帕金森综合征、注意力缺陷及多动障碍等疾病相关［7］。最近研究［4］发现，SLC6A3在肾透明细胞癌中呈高表达，且其高表达预示着患者较短的生存期，表明SLC6A3可能参与调控肾透明细胞癌的进展。事实上，肿瘤细胞利用转运蛋白来维持其自身生长并不少见，如SLC2A1（编码缺氧诱导因子）在多种肿瘤细胞中表达上调从而为癌细胞快速增殖提供充足的能量［8-9］，SLC2A3（编码高亲和力葡萄糖转运蛋白）同样在乳腺癌、结肠直肠癌和膀胱癌中呈高表达［10-12］。此外，肿瘤通常依赖谷氨酰胺来维持细胞内NADPH水平，因此许多具有转运谷氨酰胺功能的蛋白在癌细胞中表达上调［13］，表明转运蛋白的功能与肿瘤细胞发生、发展存在着某种联系。但是关于SLC6A3如何调控肾透明细胞癌细胞生长的机制并不明确。

本研究首先证实SLC6A3在肾透明细胞癌及细胞中呈高表达，表明SLC6A3可能是肾透明细胞癌诊断的生物标志物，该结果与之前的研究［4，6］一致。进一步构建shSLC6A3细胞株，发现下调SLC6A3后，细胞增殖、迁移能力显著降低，而凋亡率显著增加。VHL基因失活，从而导致细胞内缺氧，缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）增加，是肾透明细胞癌发生、发展过程中的主要特征［2］。有研究［14］发现，在人恶性胶质瘤中SLC6A3是HIF-1α的下游靶基因，具有促进癌细胞增殖与迁移的作用。所以我们推测在肾透明细胞癌中由于HIF-1α表达水平升高，从而促进了SLC6A3过表达，最终导致癌细胞增殖与迁移。

PI3K/Akt信号通路激活后能调控细胞周期相关蛋白的表达、抑制癌细胞凋亡，促进癌细胞增殖与侵袭、血管生成等，因此PI3K/Akt信号通路激活与多种肿瘤的发生密切相关［15］。有研究［16］表明，抑制PI3K/Akt信号的激活可以显著抑制肾透明细胞癌的增殖。本研究发现，与对照组比较，下调SLC6A3后细胞内PI3K及Akt磷酸化水平显著下降，表明SLC6A3可能通过调控PI3K/Akt信号通路参与肾透明细胞癌的进展。进一步采用PI3K激动剂处理shSLC6A3细胞，发现与shSLC6A3组比较，细胞增殖能力显著提高，表明SLC6A3通过调控PI3K/Akt信号通路影响肾透明细胞癌的生长。

综上，本研究发现SLC6A3在肾透明细胞癌组织中呈高表达，下调SLC6A3可抑制细胞增殖、侵袭，促进细胞凋亡。SLC6A3可能通过调控PI3K/Akt信号通路影响肾透明细胞癌的发生、发展过程。