延长不同实验步骤温育时间对HBsAg酶免结果的影响

严凤好 钟展华 曾少丽 陈媛

(惠州市中心血站 检验科 广东 惠州 516003)

ELISA 测定中影响结果的因素较多，其中温育时间是影响测定结果的最关键因素，本研究对加酶前、加酶后、显色等步骤的温育时间进行对比分析，旨在探讨ELISA 法检测不同强弱程度HBsAg 阳性标本的部分影响因素。

1 材料与方法

1.1 材料 阳性对照、阴性对照(试剂盒自带)，0.5 IU/ml质控血清(康彻思坦生物有限公司提供)，HBsAg 阳性标本36 份，其中HBsAg 弱阳性标本12 份、HBsAg 中阳性标本12 份、HBsAg 强阳性标本12份，HBsAg 阴性标本32 份(均来自本站自愿无偿献血者，并经过新创公司和梅里埃公司试剂检测)。

1.2 试剂与仪器 HBsAg 检测试剂盒(上海梅里埃生物工程有限公司生产)，STAR 全自动加样仪(瑞士HAMILTON)，FAME 全自动酶免分析仪(瑞士HAMILTON)，340RT 酶标仪(瑞士ANTHON)。

1.3 实验方法

1.3.1 对照实验 严格按照试剂说明书操作，实验步骤:①加稀释液25 μl，加标本或阴阳对照及质控品75 μl。②37 ℃温育60 min。③加酶标记物50 μl。④37 ℃温育30 min。⑤洗板5 次，加显色剂100 μl，室温(25 ℃)温育30 min。⑥加终止液，酶标仪读数。

1.3.2 实验Ⅰ 加酶前温育时间对实验结果的影响:其他步骤不变，第②步温育时间分别延长至75 min(实验A)和90 min(实验B)。

1.3.3 实验Ⅱ 加酶后温育时间对实验结果的影响:其他步骤不变，第④步温育时间分别延长至40 min(实验C)和45 min(实验D)。

1.3.4 实验Ⅲ 显色时间对实验结果的影响:其他步骤不变，第⑤步温育时间分别延长至40 min(实验E)和45 min(实验F)。

1.4 统计学方法 根据所得数据的S/CO 值，采用SPSS 17.0 软件，按α =0.05 检验水准进行方差分析、F 检验和配对t 检验。

2 结果

2.1 实验Ⅰ结果 延长加酶前温育时间对强阳性和弱阳性标本影响具有统计学意义，强阳性标本吸光度明显下降，弱阳性明显加强，并与延长的时间密切相关。

2.2 实验Ⅱ结果 延长加酶后温育时间对各标本吸光度(阴性除外)影响最明显。

2.3 实验Ⅲ结果 延长显色时间对实验结果的影响差异无统计学意义。

2.4 阴性标本结果 延长各反应步骤温育时间对HBsAg 阴性标本吸光度影响差异均无统计学意义。各实验结果见表1、2。

表1 延长不同实验步骤温育时间对HBsAg 酶免实验S/CO 值的影响(±s)

表1 延长不同实验步骤温育时间对HBsAg 酶免实验S/CO 值的影响(±s)

标本 对照 实验A 实验B 实验C 实验D 实验E 实验F阴性 0.20 ±0.03 0.20 ±0.04 0.23 ±0.01 0.19 ±0.02 0.22 ±0.03 0.19 ±0.02 0.23 ±0.03强阳性 76.68 ±0.69 69.95 ±1.29 62.40 ±1.17 71.15 ±0.62 66.15 ±1.00 76.45 ±0.68 76.05 ±1.27中阳性 7.31 ±0.10 7.30 ±0.19 7.33 ±0.17 7.52 ±0.16 7.73 ±0.12 7.17 ±0.04 7.28 ±0.09弱阳性 1.61 ±0.04 1.71 ±0.12 1.76 ±0.10 1.83 ±0.05 1.9 1 ±0.07 1.61 ±0.06 1.60 ±0.06

表2 各实验组与对照组结果比较

3 讨论

酶联免疫吸附实验属于固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相载体的表面发生，但标本中的抗体与固相抗原结合的机会并不均等，在最贴近孔壁的一层溶液中的才直接与抗原接触。该反应是一个逐渐平衡的过程，需要经过扩散才能达到反应的终点，要保证足够的温育时间，才能使产物生成达到顶峰。然而，是不是延长任何一个步骤的时间获得的效果是一样的，笔者通过实验发现并非如此。

从本实验可以看出，延长加酶前温育时间对强阳性和弱阳性标本影响显著，强阳性标本随温育时间延长吸光度明显下降，弱阳性却明显加强，两者均与延长的时间密切相关。因为ELISA 方法检测HBsAg 是一种双抗体夹心法，待测抗原既要与包被抗－HBs 结合，又要与酶标抗体(HRP－HBs)作用，反应过程中酶标抗体与包被抗体共同竞争标本的HBsAg。当HBsAg浓度在一定低值范围时，HBsAg 易受试剂中的酶标抗体(HRP－HBs)饱和而被洗脱掉，降低了灵敏度。而对于强阳性标本，标本中含有过量的HBsAg，由于“钩状”效应未能完全消除［1］，因此吸光度会反而降低，所以延长加酶前和加酶后温育时间其值都下降，并与时间成反比。通过实验我们发现延长加酶后的温育时间对各标本吸光度(阴性除外)影响最显著，这点与相关报道［2］一致，因此对于弱阳性标本，我们可以适当延长该步骤的温育时间以防止假阴性结果出现。但延长显色时间对实验结果影响并不明显，应该是试剂盒在设计时已充分考虑到包被的抗体全部被抗原结合后所需的反应时间。此外，对于HBsAg 阴性标本，延长各反应步骤温育时间对其结果影响均无统计学意义，也与有关文献报道［3－4］相吻合，表明适当延长温育时间不会造成假阳性结果。

HBsAg 检测作为判断乙肝病毒感染的指标，ELISA 以其操作简单、快速、便于大批量样本检测等优势成为首选方法。尽管市面上可供选择的试剂盒很多，但目前没有哪种可以做到100%准确，有的灵敏度高，有的特异性好，因此，在选择最佳试剂的同时，根据自身的实验条件，适当改良操作步骤，保障检测结果的准确性。ELISA 是根据着色深浅(吸光度值)判定待测抗原抗体的有无及含量，反应时间是影响实验灵敏度和准确性的关键因素，尤其是对于弱阳性标本［5］，足够的温育时间是防止假阴性出现的重要保证，选择正确的实验步骤适当延长温育时间可提高ELISA 实验结果的准确性和弱阳性标本的检出率。

［1］吴肖仙，冯淦清.影响ELISA 检测HBsAg 结果的常见因素［J］.中国药物经济学，2013，1(1):0331－0332.

［2］赵飞雪.Microlab FAME 全自动酶免分析仪检测的影响因素及质量控制［J］.检验医学与临床，2012，9(13):1677－1678.

［3］帅敏，张玲，邓晓琴，等.延长实验温育时间对FAME 全自动酶免分析结果的影响［J］.临床输血与检验，2008，10(1):28－30.

［4］陈宇.孵育时间对ELISA 检测HBsAg 和抗－HCV 结果的影响［J］.医药前沿，2012，12(35):395－396.

［5］李静，刘亚军，赵晶，等.室温对ELISA 定性测定HBsAg 检测能力的影响［J］.临床输血与检验，2011，13(4):338－340.