肿瘤突变负荷在EGFR突变型晚期非小细胞肺癌中的临床研究进展

海军军医大学附属长征医院肿瘤科，200433 上海

肺癌是中国发病率最高的恶性肿瘤，5年生存率仅19.8%，远低于日本的32.9%［1］。随着基因检测技术的发展，人们发现表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是肺癌中突变频率最高的可治疗靶点，亚洲肺腺癌人群总突变率高达50.2%［2］，EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）应用最为广泛。然而多数患者仍会在TKI治疗后8～13个月发生耐药［3］。临床实践发现，相同突变亚型的初治患者对EGFR-TKI的反应仍存在较大的个体差异。通过寻求EGFR-TKI的疗效预测因子，缩短疗效不佳患者的监测随访间隔并积极开展一线TKI联合治疗，可能会改善这部分患者的疗效及预后。

癌症是基因相关性疾病，与正常组织及肿瘤细胞中的基因突变密切相关。不同肿瘤患者与不同肿瘤类型中，每种基因突变的频率都有显著差别［4］。通过二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术全面展现突变频率相关信息，进一步指导精准治疗是近年来的研究热点。肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）是一种新型基因标志物，可反映肿瘤基因突变的总体状况，已广泛应用于免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）治疗的获益人群筛选及疗效预测［5-7］，在EGFR突变型非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中也有相应的探索性研究。本文介绍TMB的主流检测方法及其在EGFR突变型晚期NSCLC免疫治疗、靶向治疗中的应用，梳理该领域进展、争议及面临的挑战。

1 TMB概述

TMB是指肿瘤基因外显子编码区每兆碱基（Mb）中发生置换、插入或缺失突变的总数，通常按每Mb中的非同义突变数来计算［8］。肿瘤基因突变主要包括非同义突变、同义突变、插入、缺失或拷贝数的增加和减少［9］。在细胞内、外环境的共同作用（如吸烟、紫外线照射等）下，体细胞突变特征可经由mRNA转录、蛋白翻译及翻译后修饰而留存下来。这些新生肽段由肿瘤异常蛋白（tumor abnormal protein，TAP）介导转运入内质网腔，并与主要组织相容性复合体Ⅰ（major histocompatibility complex Ⅰ，MHCⅠ）结合，表达于抗原递呈细胞（antigenpresenting cell，APC）表面。这些新生肽段-MHCⅠ复合物被称为新抗原，可以激活CD8+细胞毒性T淋巴细胞，从而发挥T淋巴细胞介导的抗肿瘤效应［10-11］。综上，TMB升高，产生新抗原的数量和频率会增加，机体的免疫原性增强。

2 检测手段及临床应用

2.1 全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES）

WES包含22 000个基因编码区，检测区域为编码区的错义点突变，测序长度为30 Mb，对外显子组序列检测覆盖率高。WES最早用于探索TMB在肿瘤患者中的分布。研究［12］发现，黑色素瘤和肺癌的TMB最高，NSCLC是TMB变化范围最大的癌种，有吸烟史的患者［10.5个突变（mut）/Mb］中位TMB明显高于无吸烟史的患者（0.6 mut/Mb）［13］。但致癌诱因本身并不能完全解释NSCLC中TMB的多样性，其他因素如微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），以及基因突变如POLE突变、POLD突变、BRCA突变等，都会导致体细胞突变积累［14］。

多项临床研究应用WES探索TMB的临床应用价值。Rizvi等［14］定义高TMB为每个外显子组超过178个非同义突变，这部分接受帕博利珠单抗（pembrolizumab）治疗的NSCLC患者客观缓解率（overall response rate，ORR）、持续临床获益（durable clinical benefit，DCB）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）均有更多获益。回顾性分析CheckMate-026研究［5］的WES数据发现，高TMB（≥243 mut/Mb）患者接受纳武利尤单抗（nivolumab）治疗，临床获益显著优于含铂双药化疗，美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南［15］据此将TMB列为预测ICI疗效的新型生物标志物。随着更多研究反复证实WES在TMB检测中的地位，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）于2019年11月批准了基于WES的体外诊断平台Omics Core用于TMB和包含468个基因的体细胞突变检测（表1），标志着WES正式由研究试验转化为临床应用。

2.2 全面基因组测序（comprehensive genomic profiling，CGP）

WES成本高、周期长，对肿瘤组织标本大小和肿瘤组织含量要求高，临床实践中难以推广。而CGP除了以上优势，更重要的是其测序兼具深度和广度，标本中含有少量片段DNA时甚至可能提高突变检测灵敏度，因此目前临床更倾向于使用CGP来检测TMB［16］。

CGP在反映TMB特征方面不逊色于WES。MSKCC-IMPACT与WES配对检测204例NSCLC患者的TMB值，相关系数为0.86［6］，100 000例泛瘤种患者的F1CDx与WES检测TMB值一致率也高达95%［4］。目前，美国FDA已批准四种NGS试剂盒用于临床肿瘤诊断（表1）。然而在不同分子检测平台的CGP中，高TMB的定义仍不尽相同，因其所包含的基因数量、与肿瘤的关联性、生信分析方式均存在一定差异。因此，统一跨平台TMB检测的标准和定义最佳阈值是临床实现个性化治疗的必要条件［17］。

表1 美国FDA批准应用于临床的NGSTab.1 The types of NGS approved by American FDA for clinic use

CGP确立的TMB=10 mut/Mb已成为临床实践及研究中公认的ICI cut-off值。CheckMate 227研究［7］证实，TMB≥10 mut/Mb的同类患者接受免疫联合治疗效果优于化疗。Ⅱ期临床研究KEYNOTE-158［18］中高TMB组（TMB≥10 mut/Mb）数据显示，pembrolizumab后线治疗晚期泛瘤种患者的ORR及6、12、24个月的PFS率均超过低TMB组。基于此数据，2020年4月7日美国FDA授予pembrolizumab后线治疗TMB≥10 mut/Mb的泛瘤种患者优先评审资格。

并不是所有CGP都适合评估TMB，尤其是较小的基因集合（panel）。研究证实，基因组覆盖率＜0.5 Mb的panel评估的TMB准确性降低［4］。Endris等［19］将3种CGP panel与WES进行对比也发现，使用＞1 Mb的panel来评估NSCLC患者TMB，检测准确性和可靠性均显著提高，且通过扩大同义突变分析的有效区域也可以提高TMB计算的精准度。

2.3 血液TMB（blood-based TMB，bTMB）

部分复发或多线治疗失败的晚期肺癌患者难以取得活检组织，常令使进一步诊断及精准治疗陷入困境。因此，基于外周血循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的TMB，即bTMB检测成为近年来研究的热点。

POPLAR和OAK研究［20］中，同一患者的bTMB和肿瘤TMB（tumor-based TMB，tTMB）的匹配度高，Spearman相关系数为0.6 4。B-F1RST研究［21］则发现，cut-off值为16时，共152例接受阿替利珠单抗（atezolizumab）一线治疗的NSCLC患者中，高bTMB组ORR显著更优，但bTMB未能有效预测PFS及总生存期（overall survival，OS）的获益。Wang等［22］发现，中国人群队列bTMB的cut-off值为7时，高ctDNA突变丰度（≥5%）的患者接受免疫治疗的ORR、PFS及OS均显著优于低丰度的患者。

虽然有研究初步揭示了ctDNA含量为影响bTMB预测效能的潜在因素，但bTMB检测手段与算法仍需进一步优化。如肿瘤释放入血的ctDNA等位基因突变频率需≥1%，方可有效评估bTMB。ctDNA含量与肿瘤负荷呈正相关，最大体细胞等位基因突变频率（maximum somatic allele frequency，MSAF）≥1%的患者，其基线病灶最长直径大于MSAF＜1%的患者［20］。

3 TMB与EGFR突变型NSCLC的关系

3.1 EGFR突变型NSCLC患者TMB低

TMB在可靶向驱动基因突变［EGFR突变型、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合等］时显著降低［23］，主要原因是强势驱动基因突变抑制其他非同义突变发生。海军军医大学附属长征医院肿瘤科臧远胜教授团队［24］对953例中国泛瘤种患者的WES数据分析发现，EGFR突变型患者中位TMB低于野生型（74个非同义突变vs113个非同义突变，P=0.003 9）。该团队［25］进一步分析了1 668例欧美及292例亚洲晚期肺腺癌人群的TMB分布，总体TMB分别为6.66和4.80 mut/Mb，且野生型TMB均显著高于各突变亚型。

EGFR突变各亚型中TMB分布也有差异。Offin等［26］分析了153例EGFR经典突变患者的TMB分布，发现19del低于21 L858R（P=0.003），另一项研究［27］也发现，19del突变患者TMB水平低于L858R突变患者（P＜0.001），且19del与20ins及L861Q突变的TMB水平相似（P=0.35），G719X突变患者TMB水平高于19del突变患者（P＜0.001）。还有研究［26］发现，继发性耐药患者中，T790M阴性患者TMB在数值上高于T790M突变患者（P=0.057），这也为T790M阴性耐药患者使用ICI治疗提供了新的依据。

Offin等［26］对比了30例患者靶向治疗前和耐药后的TMB值，发现耐药后TMB显著升高（3.42 mut/Mbvs6.56 mut/Mb，P=0.000 2），但此结果尚不能成为EGFR-TKI耐药患者ICI治疗有效的理论依据。研究者认为，TMB值升高是因为在TKI治疗的选择性压力下出现的亚克隆多样性增加，但这并不能使有效的免疫抗原相应增加，故免疫治疗仍不是最优选择。

3.2 TMB预测EGFR突变型NSCLC疗效

3.2.1 预测EGFR-TKI治疗效果

Offin等［26］首次证实，TMB与EGFR-TKI治疗EGFR突变型NSCLC患者的临床获益呈负相关，研究纳入了153例晚期EGFR经典突变（19del和L858R）的NSCLC患者，这些患者均一线接受一/二代EGFR-TKI治疗。MSK-IMPACT用于评估治疗前与耐药后的TMB，并按三分位数（2.83，4.85）分为高、中、低TMB3组，生存分析显示，TMB与EGFR-TKI疗效及EGFR突变型患者预后呈负相关，高TMB组的治疗终止时间（time to treatment discontinuation，TTD）和OS显著短于中、低TMB组。高、中、低TMB3组TTD和OS分别为17、16、10个月（P=0.000 3）和40.6、37.3、20.6个月（P=0.02）。多变量分析显示，中、低TMB组的TTD和OS优势在TP53突变状态和EGFR突变亚型（19del和L858R）中同样显著。

作为第一项探索TMB预测EGFR-TKI疗效的研究，Offin等［26］的研究在设计方面仍有值得探讨的地方。首先，该研究定义高TMB值（4.85 mut/Mb）是低于既往研究的。同样使用MSK-IMPACT，Rizvi等［6］分析84例晚期NSCLC患者的免疫治疗效果，定义高TMB为＞7.4 mut/Mbo。另一种NGS panel F1CDx检测EGFR/ALK阴性NSCLC，定义＞10 mut/Mb为高TMB［7］。其次，153例患者仅有36个TMB值，很可能是因为EGFR突变型患者TMB绝对值较低，TMB值间隔不大。另外，研究者考虑到缓慢进展时仍可继续使用EGFR-TKI治疗，实际用药时间多超过PFS，故用TTD替代PFS及ORR，而不是在评估药物疗效方面更有说服力的PFS。研究者也只纳入了随访数据更完整的一/二代EGFR-TKI治疗的患者。随着奥希替尼一线适应证的获批，更多的研究将会证实TMB在三代EGFR-TKI中的疗效预测作用。

海军军医大学附属长征医院肿瘤科臧远胜教授团队［25］筛选癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中289例EGFR突变型NSCLC患者，分析了TMB与预后的关系，结果表明，将患者按TMB中位数（3.37）、三分位数（2.83，5.10）及四分位数（2.83，3.77，6.12）划分组别来进行生存分析，TMB最高组的中位OS分别24.03、21.27及21.27个月，均为最短（P=0.002，P=0.0135，P=0.018），通过更细致的划分TMB，再次证实，高TMB是EGFR突变型晚期肺腺癌的不良预后因素，研究还发现，按中位TMB与TP53是否突变将患者分为4组，高TMB及TP53突变组的EGFR突变型肺腺癌患者OS最短（P=0.000 9），TMB联合TP53可作为EGFR突变型晚期肺腺癌患者的预后标志物。然而，该研究的OS数据源于TCGA数据库，无法获得确诊时间、治疗方案等临床细节。另一方面，该研究虽然纳入了燃石数据库中中国人群的TMB数据，但多数患者随访数据不成熟，未能明确TMB对中国人群接受EGFR-TKI治疗的效果及预后预测作用。

为探究中国人群TMB与靶向治疗效果的关系，童琳等［28］纳入了3年间51例敏感驱动突变且接受小分子TKI治疗的晚期NSCLC患者，进行组织标本的panel测序，并同样按三分位数将患者分为高TMB与中低TMB两组。分析发现，高TMB组患者中位PFS显著短于中低TMB（410 dvs217 d，HR=0.331，95% CI：0.165～0.665，P=0.001 2），EGFR突变型亚组（n=42）中也得到了相似结果（410 dvs189 d，HR=0.256，95%CI：0.108～0.608，P=0.002）。入组患者的治疗药物包含了一、二代EGFR-TKI及克唑替尼，并以PFS作为研究终点，结论更贴近真实世界情况，但该研究仍存在样本量较少、缺乏OS数据及非前瞻性研究的缺陷。

随着CGP的进一步推广，针对中国人群更大规模的回顾性研究数据于近期发布。利用包含425个热点基因的CGP panel，Lin等［29］评估了98例一线接受EGFR-TKI治疗患者的TMB分布，同样是按三分位数（3.4，5.7）分析，该研究发现，低TMB组ORR显著高于中、高TMB组（53.8%、23.0%、8.3%，P=0.037），且3组PFS分别为16.4、9.0、7.4个月（P=0.006）。PFS相关影响因素的亚组分析显示，低TMB组的19del、TP53突变及年轻患者，比中、高TMB组更容易在PFS方面获益（P=0.02）。为使结论更加严谨，该研究还设计了多因素分析以排除其他临床因素对PFS的影响，发现性别、年龄、吸烟史、EGFR突变亚型及TP53突变状态均与PFS无关，强调了TMB是PFS的独立预后因素的结论。

回顾性研究反复证实，TMB是预测EGFR突变型晚期NSCLC疗效及预后的有效标志物。然而，不同NGS panel覆盖的不同基因位点会导致TMB分布的多样性，很难定义广泛适用的cutoff值。目前，仍需要前瞻性研究进一步验证在EGFR突变型和其他敏感驱动基因突变的NSCLC中，TMB作为预后生物标志物的前景。

3.2.2 预测免疫治疗效果

作为优势驱动基因，EGFR突变型患者在免疫治疗中总体获益不大，这与EGFR突变型患者肿瘤微环境的弱免疫原性、TMB低水平的特征有关［30］。CheckMate 057、KEYNOTE-010和POPLAR研究的meta分析［31］显示，程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡［蛋白］配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）抑制剂对比多西他赛二线治疗能显著延长总体患者（n=1 903，HR=0.68，95% CI：0.61～0.77，P＜0.000 1）和EGFR野生型患者（n=1 362，HR=0.66，95% CI：0.58～0.76，P＜0.000 1）的OS，但在EGFR突变型患者中OS差异无统计学意义（n=186，HR=1.05，95%CI：0.70～1.55，P＜0.81)。临床前研究［32］显示，约20 000个黑色素瘤样本中发现的20种新抗原只有8%的新抗原来自驱动基因突变，另外92%的新抗原全部来自非驱动基因突变。而新抗原的产生与TMB密切相关，是激活特异性T淋巴细胞介导的抗肿瘤效应的重要介质，这也是驱动基因突变肿瘤患者免疫治疗效果不佳的重要原因之一。

也有一些研究探讨了EGFR突变型患者后线免疫治疗的可能性，并提出TMB高表达是生存获益的潜在机制。一项日本的研究［33］探索EGFRTKI耐药后nivolumab的疗效，亚组分析显示，9例接受WES评估TMB值的患者中，有应答的3例TMB值显著高于无应答的6例（P=0.038），由此推测高TMB很可能是nivolumab获益的原因。但因样本量较小，未发现TMB在T790M突变与阴性患者中的差异（P=0.71）。另一项日本的单中心分析［34］纳入了24例经nivolumab治疗的EGFR突变型患者，单变量分析表明，高布林克曼指数（＞600）、一线EGFR-TKI持续缓解时间短、罕见EGFR突变型可延长PFS，多变量分析提示，罕见EGFR突变是nivolumab疗效的独立预后因素，这与罕见突变和重度吸烟患者TMB更高有关。

EGFR突变各亚型对免疫治疗的反应存在差异。Hastings等［27］评估了126例EGFR经典突变患者的ICI疗效与预后，发现19del突变患者ORR（7%vs22%，P=0.002）和OS（HR=0.69，95% CI：0.493～0.965，P=0.03）都显著差于L858R突变，这与19del突变患者TMB水平更低有关。另外，该研究还发现，L858R突变与EGFR野生型的ORR（16%vs22%，P=0.42）和OS（HR=0.917，95% CI：0.597～1.409，P=0.69）相似。Haratani等［33］纳入了25例二线接受nivolumab治疗的EGFR-TKI耐药患者，T790M阴性耐药患者的中位PFS长于T790M突变患者（HR=0.48，95% CI：0.20～1.24，P=0.099），提示EGFR21 L858R突变及T790M阴性的耐药患者二线可尝试使用免疫治疗。

尽管NCCN指南不推荐EGFR突变型患者行免疫治疗［15］，但以上研究均证实，一线EGFRTKI耐药后的患者仍可从ICI治疗中获益，尤其是T790M阴性获得性突变及L858R突变的患者。这两类突变亚型，均是EGFR突变中TMB相对较高的，因此高TMB可指导ICI在EGFR突变型NSCLC中的应用。

4 总结与展望

TMB是一个相对简单的参数，易于计算和重复检测，可以在各类患者队列中交叉比较。TMB的泛瘤种相关性、检测标本多样性、与免疫治疗、靶向治疗效果及预后的密切关联都预示着其有广阔的临床应用前景。TMB在EGFR突变型NSCLC领域亟需更多探索，包括TMB低表达的分子机制、继发性非T790M突变耐药患者中的TMB动态变化、TMB在化疗或联合免疫治疗中的疗效预测应用等。