白杨素Mannich衍生物的合成及其抗IgE介导Ⅰ型过敏反应活性研究

徐 军，杨美林，仲崇琳

(吉林省中医药科学院·吉林 长春 130012)

白杨素(chrysin)化学名称为5,7-二羟基黄酮(结构见图1)，是一种在自然界中常见的黄酮类化合物，以蜂蜜和蜂胶中含量较高。白杨素具有抗菌、抗敏、抗炎、抗氧化等广泛的药理活性[3]，在临床上的应用以抗炎和抗癌活性居多，但由于其水溶性和脂溶性较差，很少在肠道内吸收，且其5、7位羟基易被糖基化而使之活性降低[4]，从而限制了其在临床上的应用。近年来对白杨素的结构修饰主要集中在A环的C-6位和C-8位上，且8位的亲核活性高于6位，理论上，C-8位更易发生取代或成环反应[5-6]。Mannich碱类化合物具有抗癌、降血压、抗炎等多种生物学活性[7]。向同一分子引入不同活性基团可能会改变其生物活性[5]。因此，本文设想向白杨素C-8位引入Mannich碱基团，合成多个白杨素Mannich碱衍生物，并测定其抗敏活性。

图1 白杨素的化学结构

本实验以天然产物白杨素为起始原料，在甲醛和二甲基甲酰胺溶液条件下，与多种胺类发生Mannich反应[8-9]，得到目标化合物1a～1d，合成路线如图2所示。

图2 目标化合物的合成路线

1 实验材料

1.1 实验动物 6周龄雄性Wistar大鼠130只，体质量 170～185 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证号：SCXK-(辽)2015-0001。

1.2 实验药物与试剂 孟鲁司特钠片：购自于杭州默沙东制药有限公司，批号：M04924；白杨素：上海优纯生物科技有限公司，批号：180724。卵白蛋白(OVA)：北京鼎国昌盛分装，批号：080M1705V；瑞氏-姬姆萨染色液：珠海贝索生物技术有限公司，批号：417031；ELISA检测试剂盒(批号：20160401)、免疫球蛋白(IgE)、大鼠白三烯(LT)、组胺(His)：加拿大Biowen生物公司；所有合成相关试剂均为分析纯级别。

1.3 主要实验仪器 X-4数字显示熔点仪：北京天地宇科技有限公司；Bruker Avance-400核磁共振仪：瑞士Bruker公司，以TMS为内标；Quattro Premier XE高效液相色谱-质谱联用仪：美国Waters公司；柱层析和薄层层析硅胶：青岛海洋化工厂；680型全自动酶标仪：美国BIO-RAD公司；显微镜：日本奥林巴斯公司。

2 实验方法

2.1 目标化合物1a～1d的合成通法 将磁力搅拌子放入微波反应专用瓶，向其中加入2.54 g(10 mmol)白杨素、加入二甲基甲酰胺50 mL使其溶解，分别加入不同体积的哌嗪反应物1.71 mL(15 mmol)，再加入37%甲醛溶液(质量分数)1.23 mL(15 mmol)，混合均匀。微波反应条件为300 W、45 ℃、1 h，得反应液；将反应液冷却至室温，加50 mL水和100 mL乙酸乙酯提取，无水硫酸钠脱水，乙酸乙酯液减压蒸干，残渣加入丙酮热溶，室温放置，沉淀物用丙酮重结晶得化合物1a-1d。

8-(4-甲基哌嗪-1-甲基)-5,7-二羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(1a)：浅黄色结晶，产率：55.87%，m.p.161～163；1H-NMR (CD3Cl, 300 MHz):δ2.33 (s, 3H, -CH3), 2.71 (s, 8H, piperazine-H), 4.01 (s, 2H, -N-CH2-Ar), 6.28 (d, 1H,J=3.3 Hz, -CO-CH=), 6.63 (d, 1H,J=3.3 Hz, Ar-H), 7.53-7.58 (m, 3H, Ar-H), 7.81-7.83 (m, 2H, Ar-H), 12.18 (s, 1H, -OH), 12.71 (s, 1H, -OH).13C-NMR (CD3Cl, 75 MHz):δ45.84, 52.64, 53.69, 54.74, 98.43, 100.02, 100.17, 104.65, 105.73, 126.05, 129.17, 131.51, 131.77, 154.69, 161.56,063.04, 182.29.ESI-MS ([M+H]+): 367。

8-(4-乙基哌嗪-1-甲基)-5,7-二羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(1b)：浅黄色结晶，产率：70.12%，m.p.161～163；1H-NMR (CD3Cl, 300 MHz):δ1.10 (t, 3H,J=5.4 Hz, -CH3), 2.46 (q, 2H,J=5.4 Hz, -CH2CH3), 2.74 (s, 8H, piperazine-H), 4.01 (s, 2H, -N-CH2-Ar), 6.29 (s, 1H, -CO-CH=), 6.63 (s, 1H, Ar-H), 7.51-7.56 (m, 3H, Ar-H), 7.81-7.83 (m, 2H, Ar-H), 11.90 (s, 1H, -OH), 12.71 (s, 1H, -OH).13C-NMR (CD3Cl, 75 MHz):δ12.05, 52.06, 52.42, 52.73, 53.76, 98.48, 99.99, 100.20, 104.69, 105.76, 126.05, 129.18, 131.55, 131.78, 154.70, 161.60, 163.04, 165.71, 182.34.ESI-MS ([M+H]+): 381。

8-(4-异丙基哌嗪-1-甲基)-5,7-二羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(1c)：黄色结晶，产率：69.41% ；m.p.163～165；yield %.1H-NMR (CD3Cl, 300 MHz): δ 1.05 (s, 3H, -CH3), 1.07 (s, 3H, -CH3), 2.65-2.75 (s, 8H, piperazine-H), 3.99 (s, 2H, -N-CH2-Ar), 6.26 (s, 1H, -CO-CH=), 6.60 (s, 1H, Ar-H), 7.52-7.54 (m, 3H, Ar-H), 7.79-7.82 (m, 2H, Ar-H), 12.63 (s, 2H, -OH).13C-NMR (CD3Cl, 75 MHz): δ 18.53, 48.29, 53.06, 53.77, 54.34, 98.52, 100.00, 100.16, 104.65, 105.71, 126.03, 129.16, 131.53, 131.76, 154.67, 161.57, 163.00, 165.77, 182.32.ESI-MS ([M+H]+): 395。

8-(4-叔丁基哌嗪-1-甲基)-5,7-二羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(1d)：黄色结晶，产率：55.01%，m.p.164～166；1H-NMR (CD3Cl, 300 MHz): δ 1.09 (s, 9H, -C(CH3)), 2.73 (s, 8H, piperazine-H), 4.00 (s, 2H, -N-CH2-Ar), 6.29 (s, 1H, -CO-CH=), 6.63 (s, 1H, Ar-H), 7.52-7.56 (m, 3H, Ar-H), 7.80-7.83 (m, 2H, Ar-H), 11.56 (s, 1H, -OH), 12.70 (s, 1H, -OH).13C-NMR (CD3Cl, 75 MHz): δ 25.93, 45.55, 53.43, 53.73, 98.54, 100.00, 100.22, 104.71, 105.78, 126.06, 129.18, 131.59, 131.78, 154.72, 161.64, 163.02, 165.82, 182.41.ESI-MS ([M+H]+): 409。

2.2 大鼠体内抗敏活性测试

2.2.1 建模与给药[10-13]将130只大鼠随机分为13组(正常对照组、模型对照组、孟鲁司特组、白杨素及白杨素衍生物1a～1d高、低剂量组)，分别于第0天和第14天给予大鼠一次性腹腔注射含1 mg OVA和10 mg Al(OH)3的生理盐水1 mL；第15天，开始采用1% OVA生理盐水雾化吸入激发哮喘，每天1次，20 min/次，连续7 d，复制过敏性哮喘大鼠模型。正常对照组注射等体积生理盐水。给予OVA雾化后10 min内出现喘促、咳嗽等呼吸道痉挛梗阻症状即表示造模成功。各组于致敏前1 h至末次诱导哮喘前1 h每天灌胃给药1次，正常对照组及模型对照组给予等体积5% Tween-80水溶液。

2.2.2 观察指标及测定

2.2.2.1 外周血IgE和LT、His检测 大鼠末次雾化激发后24 h，腹腔注射300 mg·kg-1水合氯醛进行麻醉，腹主动脉采血，3 000 r/min离心10 min取上清，各组随机选取8个样本，按ELISA试剂盒说明书操作，采用全自动酶标仪测定450 nm的吸光度值，通过标准曲线计算全血IgE、His、LT含量。

2.2.2.2 全血EOS计数[14]制作全血涂片，采用瑞氏-姬姆萨染色法，镜下对白细胞进行分类计数，计数200个白细胞中嗜酸性粒细胞所占百分数，按下列公式计算：嗜酸性粒细胞数量(EOS计数)=全血白细胞数×嗜酸性粒细胞%。

2.2.2.3 BALF中EOS计数[15]大鼠腹主动脉采血后处死，消毒后打开胸腔，左侧肺支气管插管，缓慢注入D-Hanks液5 mL，停留10 s，缓慢抽回，重复3次，合并回收液约4 mL，注入消毒试管，1 500 r/min离心15 min后取少量白细胞沉淀制作涂片，按全血方法进行白细胞分类计数，剩余沉淀用4 mL生理盐水稀释，镜下进行白细胞计数，按全血方法计算嗜酸性粒细胞数量。

2.2.2.4 肺组织病理观察 大鼠采血后处死，取其右下肺组织(未经灌洗)甲醛固定，苏木精-伊红染色法进行染色，镜下观察肺组织病理学改变。

3 结果

3.1 对过敏性哮喘大鼠血清IgE、LT、His含量的影响 模型对照组大鼠血清IgE、LT、His含量与正常对照组大鼠相比明显增高，其它不同组分灌胃给药的大鼠同模型组相比，有不同程度降低，其中白杨素衍生物1a～1d作用均优于白杨素，结果见表1。

表1 各组大鼠血清IgE、LT、His含量比较

3.2 对过敏性哮喘大鼠全血、BALF中EOS计数的影响 模型对照组大鼠全血和BALF中嗜酸性粒细胞数与正常对照组大鼠相比明显增高；与模型对照组相比，白杨素衍生物1a、1b、1d可明显减少全血及BALF中嗜酸性粒细胞数量，而1c作用不明显，结果见表2。

表2 各组大鼠全血、BALF中EOS计数比较

3.3 对过敏性哮喘大鼠肺组织病理形态的影响 正常对照组大鼠肺组织结构正常，肺泡壁薄，肺泡腔透亮，未见炎性细胞浸润，且肺泡支气管黏膜上皮结构完整清晰。模型对照组可见炎性细胞的肺泡、肺泡囊、肺泡管显著变小，肺间质增生显著，肺泡支气管黏膜上皮细胞排列紊乱，成片脱落。白杨素衍生物1a～1d和白杨素组，与模型组相比肺泡壁有不同程度炎症细胞浸润，少量肺泡扩张，中小支气管内渗出物，黏膜上皮脱落及炎症细胞浸润减轻，整体上炎症面积明显减小。

4 讨论

IgE在过敏性哮喘的炎症反应中发挥着重要作用，当过敏原首次进入体内时，通过树突细胞(dendritic cell)的呈递从而引发一系列炎症级联反应：Th2细胞诱导B细胞产生大量IgE抗体及炎症因子(如IL-4、IL-9等)，IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE高亲和力受体结合形成复合物。当过敏原再次进入机体时，即可迅速与上述复合物结合，导致His、LT、前列腺素等炎症介质大量释放，引起黏液的分泌、气道平滑肌收缩、血管通透性增高等反应。特异性的IgE分子还可以与树突状细胞结合，加强其抗原呈递作用，上调肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面的IgE高亲和力受体的表达[16-17]。此外，过敏性哮喘的特征性指标之一表现为嗜酸性粒细胞增多，且许多研究表明哮喘的严重性与气道嗜酸性粒细胞浸润相关。LT在上下呼吸道的炎症中起重要作用，在诱导鼻过敏性反应方面，其强度比His强1 000多倍。在变态原诱导的鼻过敏反应中，在速发型或迟发型超敏反应阶段，LT的数量均明显增加。哮喘患者粒细胞释放LT的数量要高于正常人，所以说LT是引起过敏性哮喘的关键物质。

本实验通过向白杨素的C-8位引入Mannich碱基团，合成4个结构新颖的白杨素衍生物，提高了部分生物活性。再以Al(OH)3和OVA和为抗原，致敏和激发大鼠过敏性哮喘模型，通过测定特异性IgE、全血及BALF中嗜酸性粒细胞数量以及白三烯变化情况，对白杨素及4种白杨素衍生物的抗过敏性哮喘活性进行筛选。结果表明，模型组大鼠的血清IgE、白三烯含量明显增高，全血及BALF中白细胞及嗜酸性粒细胞数量明显增高，肺组织病理切片显示肺组织炎性细胞浸润及炎症面积明显增加。而通过一定剂量的白杨素及其衍生物给药治疗后，上述指标表现出不同程度的降低，说明白杨素衍生物1a～1d和其起始产物白杨素可明显降低大鼠血清IgE、His及白三烯含量，其中白杨素衍生物1a-1d作用明显优于天然产物白杨素；白杨素衍生物1a、1b、1d可明显减少全血及BALF中嗜酸性粒细胞数量；肺组织病理学检查结果显示，新化合物能够明显缩小肺组织炎症面积，综合各项检测指标，活性强弱次序为：白杨素衍生物1b>白杨素衍生物1c>白杨素衍生物1d>白杨素衍生物1a>白杨素。