福州MSM 人群中HIV-1 病毒株基因进化分析

近年来，中国沿海地区的艾滋病患者比例有所增加，尤其是同性恋人群已成为中国沿海城市艾滋病感染的高危人群。其中，同性恋人群中的HIV-1 病毒株亚型分布广泛，突变率高。子类型包括在欧美流行的B 类型，以及在亚太地区的CRF01_AE 和CRF07_BC[1]。在感染了不同的亚型毒株后，一些患者会产生新的亚型，例如01B，01C 和07B CPX 毒株，这些毒株在中国沿海城市中很流行，而且艾滋病毒在男同性恋者中的传播也很复杂[2]。目前，尚无关于福州流行株的分子特征和起源的报道。当前的研究表明，HIV-1 基因的突变将存在于不同的病毒株亚型中，并且病毒基因重组的能力是HIV-1 病毒突变的基本原因。这也解释了艾滋病在全球范围内难以控制的主要原因。CRF07_BC 在全国范围内引起暴发[3-4]，遗传突变正变得越来越明显，尤其是在感染了CRF07_BC 亚型的人群中，既有吸毒者又有高危男性[5]。目前流行株的全基因组序列变异和重排，但国内主要流行株的基因组分析报道很少，特别是MSM 人群中CRF07_BC 亚型株全基因序列的进化分析。同性恋人群中CRF07_BC 亚型的蛋白结构和功能对该亚型的病毒传播能力有影响，从而本研究对该亚型基因特征进行研究[6-7]。男同人群中HIV 感染率不断提高已引起世界的重视，关于性行为和感染相关性的调查正在深入。男同人群中HIV-1 不同基因型是否会引起世界流行也收受到的重点关注。通过基因进化树分析，追溯病毒的起源并分析该亚型的暴发和主要传播方式，为HIV-1 在男同人群中的流行和暴发提供预警作用，为HIV-1 的防控提供科学依据[8]。本研究的重点是对福州地区的HIV-1 的整个基因组的测序，对福州地区HIV-1 新重组毒株的基因特征的分析。并男同性恋的主要亚型CRF_07BC 的起源和流行趋势判断。从而对新流行毒株的病毒爆发趋势进行预防措施。

1 材料与方法

1.1 CRF07_BC 型血清标本中获得cDNA

收集2011 年1 月—2016 年12 月95 份福州疾病预防控制中心HIV-1 确诊患者血清标本，用日本TAKARA 公司的病毒RNA提取试剂盒；通过美国Invitrogen 公司的RNA 的反转录试剂盒获得cDNA。以下是本研究采用的反转录引物序列：3’端引物：R3.B3R（5’-ACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTATTG-3）。

1.2 env 基因扩增与进化树分析

Env 的基因片段的扩增，是通过日本TAKARA 公司的Taq 聚合酶，采用槽式PCR 法进行扩增。

第一轮PCR：

Primer-F：5’-TAGAGCCCTGGAACCATCCAGGAAG-3’

Primer-R：5’-TAGCCCSTCCAGTCCCCCCTTTTCTTTT-3’

第二轮PCR：

Primer-F：5’-CACCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGA AG-3’

Primer-R：5’AGCTGGATCCGTCTCGAGATACTGCTCCCAC-3’

1.3 基因组测序与进化树分析

福州地区HIV-1 病毒的全基因组[9]可以通过不同软件分析病毒基因的重组位点，其中BEAST v1.10、MEGA5.0、和 SimPlot_v3.5.1 三种生物软件用于新重组株的进化树分析，以及病毒基因进化和追溯起源的分析。

1.4 统计学分析

测序结果采用SPSS 版本17.0 软件进行统计分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CRF07_BC 亚型HIV-1 的env 基因的进化树分析

福州地区的HIV-1 病毒的env 基因序列进化分析结果表明46份核酸阳性中CRF_07BC 亚型18 株。本研究通过18 株CRF07_BC 亚型病毒株的env 基因序列进化树分析，结果表明福州地区的CRF07_BC 亚型主要来自印度C 亚型和缅甸的B'亚型重组而成的病毒株，传入中国云南后通过河南和江西等地进行二次传播到福州地区，所以福州地区CRF07_BC 病毒与云南、河南和江西地区的HIV-1 代表株有较高同源性，序列相似度为95.1%～98.3%，见图1。且在MS M，IDU 和其他的人群中流行的CRF07_BC 也与云南和河南等地的代表株同源性高，见图1。

2.2 CRF07_BC 亚型病毒株的Diversity plot 分析

对CRF07_BC 亚型 的HIV 病毒株（BC.FJFZ.2016.MSM6）进行全基因测序分析，结果表明全基因测序结果病毒株（BC.FJFZ.2016.MSM6）是由B 亚型和C 亚型的重组株，见图2。图2 对不同亚型的毒株用颜色代表，其中参考序列是中国最流行的HIV-1亚型。图2 CRF07_BC 参考株（97CN54）和福建新重组株（BC.FJFZ.2013.MSM6）。其中福建地区HIV-1 病毒新重组株基因中有五个重组位点，BC.FJFZ.2016.MSM6 的原始碱基主要来自C 亚型，而且在gag，pol 等基因的五个SNP 与CRF07_BC 参考株（97CN54）一致。

3 讨论

尽管目前有许多关于HIV-1 突变的研究与报告[9]，本研究重点研究对象是福建沿海地区的福州，通过该地区的CRF07_BC 亚型的基因进化进行分析，研究结果表明福州地区的HIV-1患者的病毒同源性与男同和注射吸毒者同源性高。本研究结果也显示福建MSM 人群中HIV-1 病毒的基因在变异，这也进一步说明了，福州地区的CRF07_BC 亚型HIV-1 病毒不断提高流行比例。

图1 CRF07_BC 亚型病毒株的env 基因序列进化树分析

图2 福州地区CRF07_BC（BC.FJFZ.2016.MSM6）的Diversity plot 分析

中国的HIV-1 病毒主要从20 世纪90 年代从缅甸等地区传入云南[10]。基因进化分析数据也表明了吸毒人群中CRF07_BC 和CRF08_BC 比例在不断增加，说明该亚型已缅甸传入中国。在中国，B 和C 亚型的重组形成新重组株，再并通过毒品传播路径扩增至全国各地。近年来CRF07_BC 在我国的流行率较高，尤其是在年轻MSM 人群中一直处于上升趋势，并且在部分地区已经成为主要亚型。在该国各个地区进行了福州男同性恋的流行和CRF07_BC 病毒的流行。结果表明，该新重组病毒株主要来自云南，河南和江西[11]。当第一个CRF07_BC 亚型HIV-1 进入云南地区时，通过在IDU 患者中传播，并通过MSM/ IDU 双高危人群进行二次传播到福州。因此，MSM/ IDU 双重高危人群在第二次HIV-1 流行病向全国各地蔓延中起关键作用。

BC.FJFZ.2016.MSM6 基因组进化分析结果，目前福州地区主要流行的CRF07_BC 亚型与参考值株（97CN54）序列基本一致。由于福州地区人流复杂来自世界各地，今年通过不同方式传播到了中国的其他发达地区[12]。因此，福州的CRF07_BC 向中国其他地区扩散的方式复杂。HIV 的重组亚型多样性性，且不同亚型的HIV-1 病毒传播途径和耐药性也在改变。因此，及时对福州地区男同人群中HIV-1 亚型的变化以及识别新的CRF 和URF 病毒重组株进行追踪，从而有利于对福州地区HIV-1 男同人群中合理使用抗逆转录病毒药物，开发新药和开发疫苗提供依据。