胆畅心宽茶对小鼠胆囊胆固醇结石形成影响的实验研究

沈惟一 刘兆娜 姚依影 胡海 王毅兴

摘 要 目的：探究胆畅心宽茶对小鼠胆囊胆固醇结石形成影响及潜在机制。方法：给予小鼠普通饲料+/-胆畅心宽茶以及成石饲料+/-胆畅心宽茶，每组9只。喂养4周后处死采集血清、胆囊胆汁、肝脏等标本做检测。结果：单纯成石饲料组小鼠，胆囊内均出现肉眼结石以及镜下胆固醇结晶100%，而成石饲料加茶组肉眼结石只有44%，镜下胆固醇结晶78%。在普通饲料及成石饲料、饮茶小鼠胆汁中β-鼠胆酸比例均显著增高。成石饲料加茶组，肝脏胆汁酸代谢相关基因Cyp8b1表达下降，Cyp2c70表达上升。结论：胆畅心宽茶能预防胆囊胆固醇结晶/结石形成，可能与促进β-鼠胆酸合成，提高胆汁中胆汁酸亲水性有关。

关键词 胆石病 胆固醇 中药

中图分类号：R286； R285.5 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）03-0063-05

*基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目“茵陈蒿汤阻断毒性胆汁酸对SCF/c-kit通路的影响治疗胆石症的研究”（81603560）；浦东新区卫健委临床中医高峰学科建设项目（PDZY-2018-0603）

Experimental study on the effect of Danchangxinkuan tea on cholesterol gallstone formation in mice*

SHEN Weiyi1， LIU Zhaona1， YAO Yiying1， HU Hai1**， WANG Yixing2***（1. Center of Gallbladder Disease； 2. Department of Traditional Chinese Medicine， Shanghai East Hospital affiliated to Tongji University， Shanghai 201200， China）

ABSTRACT Objective： To explore the potential mechanism and the effect of Danchangxinkuan tea on the formation of cholesterol gallstones in mice. Methods： Nine mice in each group were given chow diet +/- tea or lithogenic diet +/- tea. After 4 weeks of feeding， mice were sacrificed to collect serum， gallbladder bile， liver and other specimens for testing. Results： Gross stones and cholesterol crystals found in the gallbladder of all mice accounted for 100% in the lithogenic diet group when observed by naked eyes or under the microscope， only 44% （by naked eyes） and 78% （under the microscope） in the lithogenic diet plus tea group. The ratio of β-murocholic acid in the bile of tea-drinking mice was significantly increased in both diets. The expression of liver bile acid metabolism-related gene Cyp8b1 decreased while the expression of Cyp2c70 increased in lithogenic diet plus tea group. Conclusion： Danchangxinkuan tea can prevent gallbladder cholesterol crystals/stone formation， which may be related to the promotion of β-murocholic acid synthesis and the improvement of hydrophilicity of cholic acid in bile.

KEY WORDS gallstone； cholesterol； traditional Chinese medicine

膽囊胆固醇结石病（简称：胆石病）是临床常见疾病，约90%为胆固醇结石[1]。目前研究认为其发生有关的病理生理异常包括：①肝脏向胆汁中分泌过多胆固醇；②胆汁中胆汁酸和磷脂相对不足；或两者兼有，导致胆汁中胆固醇的溶解平衡被破坏，胆固醇结晶容易形成进而发展成胆固醇结石[2]。

茶、麦芽等日常食品也被证明具有降血脂降胆固醇的作用，可能对胆石病具有一定的防治作用[3]，近期一项基于台湾地区人口的调查显示，适量的饮茶有助于降低胆囊结石的发病率[4]，进一步证实了日常饮食一定程度上可预防胆囊结石的形成。胆畅心宽茶根据“胆病从肝论治”及“六腑以通为用、以降为顺”的传统中医理论，以白茶，蒲公英等具有疏肝，利胆，理气作用的中药成分制成茶包。本研究拟通过小鼠胆囊胆固醇结石病模型，观察胆畅心宽茶对于结石形成的预防作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠36只购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。Trizol总RNA提取试剂、反转录试剂盒和定量PCR SYBR Green染料试剂盒均购自ThermoFisher Scientific公司。磷脂检测试剂盒购自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation。总胆固醇试剂盒购自上海科华生物。

胆畅心宽茶成分为白茶、茯苓、蒲公英、葛根、桔梗、麦芽、枸杞子、淡竹叶、玳玳花、枳棋子、重瓣红玫瑰，由上海上海脉语方食品有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备

所有小鼠随机分为4组（n=9只/组）：①普通饲料+饮用纯净水组（chow diet，CD组）；②普通饲料+饮用胆畅心宽茶（CT组）；③成石饲料+饮用纯净水（lithogenic diet，LD组）；④成石饲料+饮用胆畅心宽茶（LT组）。成石饲料配方为普通饲料加0.5%胆固醇+0.25%胆酸。胆畅心宽茶配制：3 g茶叶用100 ml沸水浸泡4 h。水或茶为随意饮用。所有小鼠喂养4周后处死，采集血清、肝脏，观察胆囊结石形成情况，及偏光显微镜下观察胆固醇结晶。

1.2.2 肝脏基因表达的检测

采用Trizol试剂法提取肝脏组织总RNA。按照逆转录试剂盒说明，将2 mg RNA逆转录获得cDNA并1∶10稀释后，用定量PCR仪检测基因表达，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）作为内参。采用双DeltaCt法计算基因相对表达量。

1.2.3 胆汁成分测定

分别采用胆固醇试剂盒及磷脂检测试剂盒测定胆汁中胆固醇及磷脂浓度含量。采用UPLC-MS测定胆汁酸成分。根据Carey表计算胆汁胆固醇饱和指数[5]。

2 结果与分析

2.1 小鼠胆囊及胆结石观察

成石情况见表1。LD组小鼠胆囊内均浑浊，LT组2只小鼠外观清澈透亮，无结晶/结石形成（图1），4只可见结石形成，剩余3只仅在镜下可见胆固醇结晶。偏光显微镜下LD、LT组观察结果见图2。

2.2 胆汁中胆汁酸组分比较

小鼠胆汁中胆汁酸成分见表2。普通饲料喂养下，CT组胆汁中胆酸（cholic acid，CA）比例较CD组下降，b-鼠胆酸（b-MCA）比例则上升（P<0.01）。成石饲料喂养下，上述差异趋势依然存在，LT组b-鼠胆酸比例相较LD组上升（P<0.05）。饮用胆畅心宽茶的小鼠，胆汁中b-鼠胆酸与胆酸含量的比值升高（图3）。

2.3 肝脏胆汁酸代谢通路相关酶的基因表达差异及肝脏损伤情况

普通饲料组小鼠，CD组与CT组两组间胆汁酸合成通路的关键酶表达无显著差异。成石饲料喂养小鼠，LT组较LD组胆汁酸代谢相关基因Cyp8b1表达下降（P<0.05），Cyp2c70表达量上升（P<0.01，图4）。CT组对比CD组，LT组对比LD组，血清中转氨酶ALT、AST均未出现升高（结果未列出）。

3 讨论

本研究发现，饮用胆畅心宽茶具有降低小鼠胆囊胆固醇结晶/结石形成的作用。这种作用与饮用胆畅心宽茶调控肝脏胆汁酸合成关键酶表达，促进b-MCA含量有关。

胆固醇转化为胆汁酸是机体清除胆固醇的重要途经，该过程仅在肝脏中发生。胆固醇首先由P450酶系中的7a-羟化酶（Cyp7a1）形成7a-羟化胆固醇，继而通过12a-羟化酶（Cyp8b1）以7a-羟化胆固醇为底物，生成终产物胆酸（CA）。在小鼠中，细胞色素P450酶系2族C70（Cyp2c70）可将鹅去氧胆酸（CDCA）和熊去氧胆酸（UDCA）转化生成b-鼠胆酸[6]。这些酶的活性决定了胆汁中各胆汁酸成分的比例[7]及胆汁酸的疏水性，而后者对于影响胆汁对胆固醇的溶解度[8]以及肠道胆固醇摄取具有重要作用。

本研究中发现LT组肝脏Cyp2c70表达上升，这与胆汁中b-鼠胆酸的比例增加有关。不论是普通饲料还是成石饲料，给予胆畅心宽茶的小鼠b-MCA含量以及b-MCA与CA的比值均高于对照组。Heuman[9]的研究发现，与牛磺酸和甘氨酸结合的b-MCA疏水指数分别为-0.78和-0.73，远低于CA（0，0.07）、CDCA（0.46，0.51）等常见胆汁酸。由此可见，胆畅心宽茶具有促进Cyp2c70增加b-MCA合成及其在膽汁中比例，进而预防结石形成。

此外，肝脏Cyp8表达下降与之相应的CA也出现了下降的趋势，这可能是胆畅心宽茶减少胆固醇结石的又一机制。Cyp8b1敲除的小鼠胆汁酸循环池更大，对于日常饮食中胆固醇和脂质的吸收更少，并且更不易形成胆固醇结石[10]。Cyp8b1敲除后，小鼠完全丧失CA而b-MCA合成增加，即使给予成石饲料，其胆汁胆固醇饱和度显著降低，且形成胆固醇结晶明显减少[11]，这与本研究中的饮茶组小鼠效应类似。

小肠中胆固醇的吸收对于维持机体胆固醇的平衡同样重要，其中尼曼-匹克C1样蛋白1（Npcil1）被认为是胆固醇吸收中最重要的转运体之一。这种蛋白负责将肠道内胆固醇转运入细胞内，而肠细胞吸收的胆酸和脱氧胆酸可通过细胞内信号传导途径，提高Npcil1的表达，增加胆固醇吸收[12]。另外，肠道胆固醇的吸收率会随着外源饮食给予的胆汁酸亲水性上升而下降，其原因可能是亲水性胆汁酸降低肠腔内微胶粒中胆固醇的溶解度，影响吸收。因此，降低胆汁胆盐池的疏水性指数会降低小肠细胞对胆固醇的生物利用度。

除了上述通过胆汁酸成分改变影响结石形成的机制外，胆畅心宽茶可能在吸收或排泄胆固醇方面也有一定的效应，其主要成分白茶富含的茶多酚被证明能影响脂质胶粒的扩散运动，调节胆固醇的吸收[13]。另一方面，茶多酚或分泌的胆汁酸又可以充当肠道法尼酯X受体（FXR）的激动剂[14]，增加下游胆固醇经肠道排泄（TICE）的量，减少胆固醇的吸收[15]。茶多酚也可以直接减少肠道胆汁酸的再吸收，从而增加了随粪便排出的胆汁酸及脂质[16]。除了白茶，胆畅心宽茶配方内的几味中药（如蒲公英、代代花、葛根等）均可通过激活AMPK（AMP依赖蛋白激酶）通路，下调Srebp-1C（胆固醇应答元件结合蛋白1c）而降低体内甘油三酯及低密度脂蛋白的生成[17]，这与本研究发现的小鼠体重下降趋势相符。本研究通过动物实验发现胆畅心宽茶对于胆固醇性结石具有一定预防作用，但受限于实验条件并未对背后更进一步的分子调控机制进行探究，另实验对象胆畅心宽茶为冲泡饮用，小鼠个体摄入量并不完全一致。后续如有进一步实验的条件可将其萃取制成粉剂，定量给予小鼠。

總体而言，胆畅心宽茶能够减少饮食诱导的胆固醇结石形成，其机制可能主要是通过减少胆汁中疏水性胆汁酸，增加亲水性胆汁酸如b-鼠胆酸的比例，增加胆固醇在胆汁中的溶解度，从而减少胆固醇的析出。

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