宫颈癌组织中TGIF2表达及对癌细胞增殖、迁移和侵袭影响

秦 瑛 雷小妹 岳珍妮 张金伟

1.桂林医学院第二附属医院(541100)；2.南京医科大学附属无锡市人民医院

宫颈癌是女性中常见的恶性肿瘤之一[1]。肿瘤的浸润及转移是宫颈癌患者治疗失败和死亡的主要原因[2]。寻找与宫颈癌恶性表型相关的靶标对宫颈癌研究有重要价值。同源异形结构域蛋白转化生长影响因子(TGIF)家族[3]在肿瘤[4]、代谢[5]和组织分化[6]等方面发挥至关重要的调控作用。因子同源盒2(TGIF2)是TGIF家族中的重要成员之一[7]。研究已发现TGIF2在肿瘤细胞中高表达，且能够抑制细胞增殖、迁移和侵袭[8]，非小细胞肺癌[9]，胃癌[10]，乳腺癌骨转移[11]等。然而，在宫颈癌中TGIF2的表达以及对宫颈癌细胞生物学功能的影响少见报道。本研究探讨TGF-β诱导的因子TGIF2在宫颈癌组织中的表达及对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 临床样本

选择2016年7月—2019年7月在本院手术切除并经病理证实的76例宫颈癌患者宫颈癌组织标本为观察组，年龄(54.0±10.1)岁(35～76岁)；同期良性子宫肌瘤手术切除的65例正常宫颈组织为对照组，年龄(53.0±9.1)岁(36～71岁)。所有患者术前均未进行放化疗以及生物治疗。本次研究已取得患者及其家属知情同意书，并获得医院伦理委员会批准。

1.2 细胞株及主要试剂

人宫颈癌细胞HeLa细胞(BH-C3294)购买于上海博湖生物科技有限公司；青链霉素(30-004-ci)购买于美国Corning公司；细胞培养基DMEM(C11995500BT)、胎牛血清(1618862)购买于美国Gibco公司；胰蛋白酶(T2600000)购买于美国Sigma公司；逆转录试剂盒(RR037A)、荧光定量PCR检测试剂盒(DRR096A)购买于大连宝生物工程有限公司；iView DAB染色试剂盒(DA1015)购买于北京索莱宝科技有限公司；Lipo6000TM转染试剂(C0526)、MTT(ST316)、RIPA裂解液(P0013B)购买于上海碧云天生物技术有限公司；siRNA-TGIF2、siRNA-NC由上海吉玛制药公司设计并合成；TGIF2抗体(ab190152，兔多克隆抗体)、Cyclin D1抗体(ab16663，兔多克隆抗体)、MMP2抗体(ab97779，兔多克隆抗体)、GAPDH抗体(ab181602，兔单克隆抗体)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)购买于上海艾博抗贸易有限公司。

1.3 细胞培养与转染

将人宫颈癌HeLa细胞在含有10% FBS、双抗的DMEM培养基中培养，37℃ 5% CO2，每3天换液1次。将状态良好的HeLa细胞接种至6孔板中，每孔2×105个细胞。分组：空白对照组、TGIF2抑制(siRNA-TGIF2)组、阴性对照(siRNA-NC)组。分别进行转染，分别用100 μl无血清DMEM培养基稀释5 μl Lipo6000TM转染试剂和8 μl转染物，室温静置5 min后混合，室温静置5 min。将混合物均匀滴加到孔内轻轻混匀。置培养箱培养8 h后更换含有10% FBS、双抗的DMEM培养基，置培养箱中培养48 h。

1.4 免疫组化染色实验

将宫颈癌组织、正常宫颈组织置多聚甲醛中固定，然后在不同浓度乙醇中脱水，石蜡包埋切片。置柠檬酸盐缓冲液中，100℃ 5 min。加入一抗(1:100)，4℃过夜孵育。使用iView DAB染色试剂盒在自动载破片染色仪中检测。

1.5 qRT-PCR实验

细胞中的RNA使用TRIzol试剂提取。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。配制qRT-PCR反应体系，反应条件为94℃预变性30 s，35个循环扩增反应(94℃ 5 s，60℃ 20 s)。以GAPDH为内参，通过2-△△Ct法计算TGIF2的相对表达量。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.6 MTT实验

将状态良好的宫颈癌HeLa细胞接种至96孔板中，每孔5×103个细胞。细胞贴壁后吸去培养基。将siRNA-TGIF2、siRNA-NC转染至细胞中培养48 h后，吸去培养基。加入0.5% MTT至孔中培养4 h，吸去培养基。加入100 μl DMSO对甲瓒进行溶解，室温震荡5 min。使用酶标仪在490 nm处测定其OD值。

1.7 Transwell侵袭实验

使用400 μl无血清培养基对50 μl Matrigel 基质胶进行稀释，并对Transwell小室底部膜进行包被、水化。取处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×106cells/孔，在37℃ 5% CO2培养箱中进行贴壁。吸去培养基。将siRNA-TGIF2、siRNA-NC转染至细胞中培养48 h后，吸去培养基。使用胰酶消化HeLa细胞并用无血清培养基重悬，使用台盼蓝染色技术调整细胞密度为5×105cells/L。取200 μl细胞悬液加至Transwell小室的上层，Transwell小室下层中加入500 μl 10%血清完全培养基，在培养箱中培养12 h后取出小室，1×PBS清洗。4%多聚甲醛固定20 min，1×PBS清洗3次。使用0.1%结晶紫染色30 min，1×PBS清洗后，每个小室随机选择5个视野，计数下室中染色的细胞以此来反应细胞侵袭能力。

1.8 划痕实验

取处于对数生长期的宫颈癌HeLa细胞接种于6孔板中，细胞密度为1×107cells/孔，在37℃ 5% CO2培养箱中培养且细胞贴壁后，使用细胞刮在板上刮出2 cm宽无细胞区域，用1×PBS洗涤2次，在划痕处做好标记。分组：空白对照组、TGIF2抑制组、阴性对照组。按照实验设计分别进行转染后培养48 h。弃上清，加入1 ml甲醇固定细胞5 min，弃甲醇。显微拍照5张，计算并评估细胞迁移能力。

1.9 Western blot实验

将状态良好的HeLa细胞接种至6孔板中，每孔2×105个细胞。分组：空白对照组、TGIF2抑制组、阴性对照组。按照实验设计分别进行转染后培养48 h。收集细胞并使用RIPA裂解液裂解。离心15 min获得细胞中总蛋白通过BCA法测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE缓冲液电泳，转膜。丽春红染色后使用5%脱脂牛奶对PVDF膜进行封闭。加入一抗(1:1000)，4℃孵育过夜。加入二抗(1:3000)室温孵育1 h。清洗后使用ECL发光液进行曝光，通过Image J软件分析相关条带的光密度值。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 宫颈癌组织中TGIF2的表达

TGIF2的阳性表达主要定位于细胞质、部分定位于细胞核，呈棕黄色颗粒。TGIF2阳性表达率正常宫颈组织(18.5%，12/65)低于宫颈癌组织(81.6%，62/76)(χ2=46.363，P<0.05)。见图1(2251页)。

2.2 患者TGIF2表达水平与临床病理特征关系

TGIF2阳性表达与患者年龄、病理类型和淋巴结转移无关，而与肿瘤分化程度、FIGO分期有关(P<0.05)。见表2。

表2 宫颈癌患者TGIF2表达与临床指标关系[例(%)]

2.3 转染后各组 HeLa细胞TGIF2表达水平

与空白对照组(1.00±0.13)和阴性对照组(1.02±0.14)相比，TGIF2抑制组TGIF2 mRNA表达水平(0.46±0.06)降低(F=22.423，P<0.05)。与空白对照组(0.96±0.05)和阴性对照组(0.98±0.06)相比，TGIF2抑制组TGIF2蛋白表达水平(0.22±0.02)降低(F=250.832，P<0.05)。见图2(2251页)。

2.4 抑制TGIF2表达对各组 HeLa细胞增殖活性的影响

MTT检测各时点各组HeLa细胞吸光度值，24 h后TGIF2抑制组HeLa细胞的吸光度值低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。见表3。

表3 各组不同时点 HeLa细胞增殖活性比较

2.5 抑制TGIF2表达对各组 HeLa细胞迁移、侵袭的影响

穿膜细胞数，TGIF2抑制组(52.33±9.61)低于空白对照组(136.33±11.50)和阴性对照组(157.00±16.09)(F=57.183，P<0.05)。细胞划痕实验表明，转染24 h后，TGIF2抑制组划痕宽度(0.75±0.05)高于空白对照组(0.26±0.03)、阴性对照组(0.23±0.02)(F=220.091，P<0.05)。见图3(2251页)。

2.6 抑制TGIF2表达对各组 HeLa细胞cyclin D1和MMP-2蛋白表达影响

TGIF2抑制组cyclin D1和MMP-2蛋白表达水平(0.55±0.06、0.30±0.03)低于空白对照组(1.02±0.08、1.01±0.06)和阴性对照组(1.02±0.07、1.02±0.05)(Fcyclin D1蛋白=50.028，FMMP-2蛋白=217.100，均P<0.05)。见图4(2251页)。

3 讨论

宫颈癌具有高发病率，高死亡率[12]。目前临床上多采用手术治疗和放化疗治疗，但因特异性不强，常会导致正常细胞受损，具有毒副作用大、疗效差等缺点[13-14]。寻找能够导致宫颈癌发生的特异性基因对宫颈癌诊断治疗有重要研究意义。

TGIF2编码的蛋白质是一种与DNA结合的转录因子，能够通过多种方式参与肿瘤的调控作用[15]。Tian等[16]研究发现在皮肤癌中TGIF2能够促进癌症转移。Liu等[4]研究发现非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)通过负调节miR-129来上调TGIF2，进而促进人骨肉瘤MG63细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，与正常宫颈组织相比较，宫颈癌组织中TGIF2表达升高，且与肿瘤的分化程度相关，但与患者年龄、病理类型以及淋巴结转移无关。这与TGIF2在皮肤癌[16]、膀胱癌[17]、神经胶质瘤细胞[8]、多发性骨髓瘤[18]中的表达结果相一致。

迁移和侵袭是肿瘤细胞主要恶性生物学行为，常导致治疗失败。Diao等[8]研究发现miR-129-5p通过靶向TGIF2能够抑制神经胶质瘤细胞U87和U251的增殖、迁移和侵袭能力，同时阻断细胞周期并诱导细胞凋亡的发生。Lu等[9]研究发现miR-541-3p通过靶向TGIF2抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的生长和转移；HU等研究[10]发现miR-34a通过靶向TGIF2抑制胃癌的肿瘤侵袭和转移。本研究以HeLa细胞株为研究对象，探究TGIF2的表达对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果显示TGIF2抑制组中TGIF2 mRNA表达量和蛋白含量均降低，功能性实验结果显示HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭能力降低。

肿瘤细胞黏附能力减弱、肿瘤细胞与基底膜的紧密附着、细胞外基质的降解、肿瘤细胞通过基底膜键入血液循环等均是肿瘤细胞侵袭和转移的主要组成过程[19]。基质金属蛋白酶2(MMP-2)在肿瘤的生长[20]、侵袭和转移[21]、肿瘤血管形成[22]中有重要作用。细胞调控因子Cyclin D1不仅与细胞周期[23]相关，还有肿瘤的运动有一定关系。宋文荣等[19]研究发现lncRNA NEAT1通过靶向miR-4262影响甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，与对照组和阴性对照组相比，TGIF2抑制组中MMP-2蛋白表达量及Cyclin D1蛋白含量降低，提示TGIF2可能通过抑制MMP-2、Cyclin D1表达而抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。

综上所述，TGIF2在宫颈癌组织及HeLa细胞株中高表达，抑制TGIF2表达可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，TGIF2可能是促癌基因在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色，有望为宫颈癌的治疗提供一个新的靶点。