表没食子儿茶素-3-没食子酸酯对细胞色素P450酶活性的影响

(潍坊医学院附属医院药学部，山东 潍坊 261031)

茶多酚是茶叶中多元酚类化合物的总称，其中表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)约占茶多酚总量的50%～60%[1-2]。EGCG含有大量活性酚羟基，是茶叶中生物活性最高的儿茶素[3-5]。研究显示EGCG具有抗癌、抗突变等生物活性，被广泛用于提高人体免疫力、降低血脂、预防动脉粥样硬化等方面，对心血管、内分泌及免疫系统具有保护作用[6-8]。此外，茶叶是亚洲地区人群较受欢迎的饮品之一，定期饮茶已成为一部分人的一种基本生活习惯。在患者接受药物治疗期间，茶叶中的儿茶素类物质可能会与其他药物产生相互作用，从而影响药物的疗效。

CYP450酶在绝大多数内源性和外源性分子生物代谢过程中，尤其是药物的代谢过程中均发挥有重要作用[9-10]。在与不同药物联用时，CYP450酶能够介导不同药物间的相互作用，进而影响药物活性及治疗效果[11]。CYP1A2酶、CYP3A4酶、CYP2A6酶、CYP2E1酶、CYP2D6酶、CYP2C9酶、CYP2C19酶及CYP2C8酶是CYP450酶的主要亚型，参与了约90%药物的代谢过程，如CYP3A4酶参与了钙离

子拮抗剂(硝苯地平、尼莫地平等)的代谢过程，CYP2E1酶参与了含氟类的吸入麻醉药的代谢过程。先前研究已发现有大量影响CYP450酶各亚型活性的药物，且导致不良的药物-药物相互作用，影响药物的血药浓度以及代谢速率[12-14]。因此，探究EGCG对CYP450酶各亚型活性的影响，对EGCG的临床应用及与其他形式的药物联用具有重要意义，但目前关于EGCG对CYP450酶各亚型活性的影响还鲜有报道。本研究旨在探讨EGCG在人肝微粒体中对这8种主要的CYP450亚型酶活性的影响，并对活性受影响酶的抑制模型进行拟合分析。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

EGCG、非那西丁、对乙酰氨基酚、4-羟基苯甲妥英、7-羟基香豆素、4′-羟基双氯芬酸、磺胺苯咪唑、奎尼丁、环丙亚胺、氯唑沙宗、6-羟基氯唑沙宗、紫杉醇、6β-羟基睾丸酮、氯甲唑和呋喃茶碱购自美国Sigma公司；孟鲁司特购自北京Aleznova制药(中国北京)；香豆素、双氯芬酸、右美沙芬和酮康唑购自美国ICN Biomedicals公司；人肝微粒体购自美国BD公司；NADPH购自瑞士Roche公司。

1.2 人肝微粒体实验

1.2.1实验分组 实验分为3组，以未处理的肝微粒体作为阴性对照组，与100 μmol/L EGCG共培养的肝微粒体为EGCG组，阳性对照组为CYP450酶各亚型特异性抑制剂处理组。EGCG反应浓度为100 μmol/L，同时选择CYP450酶各亚型特异性抑制剂作为阳性对照，其中CYP1A2酶、CYP3A4酶、CYP2A6酶、CYP2E1酶、CYP2D6酶、CYP2C19酶以及CYP2C8酶的特异性抑制剂分别为10 μmol/L呋喃茶碱、1 μmol/L酮康唑、10 μmol/L反式环丙胺、50 μmol/L氯甲咪唑、10 μmol/L噻吩、50 μmol/L丙基环丙胺、5 μmol/L孟鲁司特。

1.2.2EGCG对CYP450酶各亚型活性的影响 EGCG对CYP450酶各亚型活性的影响在人肝微粒体中进行，参考之前研究报道设定的标志反应及培养条件[15-16]，如表1所示。孵育体系为200 μL，包括100 mmol/L磷酸钾缓冲溶液(pH 7.4)，NADPH再生系统(1 mmol/L的NADP+，5 mmol/L的G-6-P，4 kU/L的6-磷酸葡萄糖脱氢酶及5 mmol/L的MgCl2)，一定浓度的人肝微粒体及探针底物(表1)。反应开始前，上述孵育体系需要在37 ℃下预培养3 min，之后加入NADPH系统引发反应。以100 μL乙腈结束反应，其中仅CYP2A6酶反应体系以体积分数为0.1的三氯乙酸结束反应。将混合物置于冰上并进行离心，通过高效液相色谱法(HPLC)定量分析代谢产物。

表1 CYP450酶各亚型标志反应及培养条件

1.2.3抑制模型及相关参数的计算 通过下列方程进行抑制模型相关参数的拟合计算。竞争性抑制：v=(VmaxS)/[Km(1+I/Ki)+S]，非竞争性抑制：v=(VmaxS)/[Km+S(1+I/Ki)]，其中v是反应速率，I是EGCG的浓度，Ki是抑制常数，S是底物浓度，Km是达到最大反应速率(Vmax)一半时的底物浓度。

1.2.4浓度依赖性实验 分析不同浓度(0、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L)EGCG对CYP1A2酶以及CYP3A4酶活性的影响，计算两种酶对应的IC50值。以0～50 μmol/L EGCG孵育不同浓度的两种探针底物(20、40、60、100 μmol/L睾丸激素及25、50、100、200 μmol/L非那西丁)，分析两种酶抑制类型及相应Ki值。

1.3 时间依赖性实验

在含NADPH的系统中将EGCG(20 μmol/L)与肝微粒体(1 g/L)置于37 ℃的条件下先预孵育30 min。孵育后，将等分试样(20 μL)转移至另一个孵育管(最终体积为200 μL)中，该孵育管中含有NADPH生成系统和探针底物，使得探针底物最终浓度约为Km。将转移后的孵育管进一步培养0、5、10、15、30 min后，通过加入100 μL乙腈内标混合物终止反应，然后将培养后的混合物置于冰上，并通过HPLC测定相应的代谢产物。分别于不同的预孵育时间(0、5、10、15、30 min)后，加入较高的探针底物浓度(约4倍Km值)和不同浓度(0、2、5、10、20、30 μmol/L)的EGCG进行培养，重复上述两步孵化过程。通过不同浓度EGCG对CYP3A4酶剩余活性的自然对数进行回归分析计算获得初始速率常数(Kobs)，对Kobs与EGCG浓度进行非线性拟合确定CYP3A4酶失活的KI和Kinact值。其中KI为反应速率达最大失活速率一半时的EGCG浓度，Kinact为酶失活的最大反应速率。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 EGCG对CYP450酶各亚型活性的影响

与阴性对照组相比，阳性对照组CYP450酶各亚型的活性均有显著降低(F=4.15，P<0.05)，而EGCG组仅CYP1A2酶和CYP3A4酶的活性显著降低(F=3.92、4.03，P<0.05)，见表2。不同浓度的EGCG抑制实验显示，EGCG对CYP1A2酶和CYP3A4酶的抑制作用随EGCG浓度的升高而增强，EGCG抑制CYP1A2酶的IC50为8.69 μmol/L，抑制CYP3A4酶的IC50为14.07 μmol/L(图1)。

表2 各组CYP450酶亚型活性比较(χ/%)

2.2 EGCG对CYP1A2酶以及CYP3A4酶的抑制类型

Lineweaver-Burk图显示，EGCG对CYP1A2酶的抑制作用为竞争性抑制，反应速率Vmax随着EGCG浓度增大保持不变，Ki值为4.16 μmol/L(图2)；而对CYP3A4酶的抑制作用为非竞争性抑制，反应速率Vmax随EGCG浓度的增大而减小，Km保持不变，Ki值为7.21 μmol/L(图3)。

另外，时间依赖性实验显示，EGCG对CYP3A4酶的抑制作用随着培养时间的延长而增加，0、2、5、10、20、50 μmol/L浓度EGCG对应的Kobs值分别为0、0.011 1、0.020 4、0.031 5、0.041 9、0.042 3(图4A)，而对CYP1A2酶的抑制作用不受培养时间影响，CYP3A4酶的KI值为6.38 min-1，Kinact值为0.047(μmol/L)-1(图4B)。

A：CYP3A4酶，B：CYP1A2酶

A：Lineweaver-Burk图，B：Ki值的计算图(纵坐标为图A各浓度曲线的斜率，横坐标为EGCG浓度)

3 讨 论

CYP450酶是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，作为肝脏中重要的药物代谢酶，参与多种药物的体内代谢过程[17-20]。CYP450酶活性直接影响经其代谢的药物在体内的有效浓度和作用时间，进而影响药物的药效及用药安全性[21-22]。EGCG因其具有抗癌、抗突变等生物活性，广泛应用于心脑血

A：Lineweaver-Burk图，B：Ki值的计算图(纵坐标为图A各浓度曲线的斜率，横坐标为EGCG浓度)

A：不同浓度EGCG与CYP3A4酶剩余活性自然对数的回归分析Kobs值，B：Kobs值与EGCG浓度非线性拟合获得KI与Kinact

管疾病的临床治疗中[23-27]。在我国居民饮茶文化源远流长，EGCG是茶叶的主要成分，对CYP450酶各亚型活性影响的相关研究结果，将对药物联合使用及用药期间的饮食具有重要参考意义。

本文研究了EGCG对人肝微粒体中CYP450酶常见的8种亚型活性的影响。结果显示，EGCG可显著抑制CYP1A2酶与CYP3A4酶的活性，且对两种酶活性的影响与EGCG的浓度呈相关性。通过Lineweaver-Burk分析发现，EGCG能够竞争性抑制CYP1A2酶，而对CYP3A4酶的抑制作用为非竞争性抑制。此外，时间依赖性实验表明，EGCG对CYP3A4酶的抑制作用受培养时间影响，随培养时间的延长而增强。这些结果都揭示了在药物治疗期间EGCG可能会使得经CYP1A2酶和CYP3A4酶代谢的药物代谢速率减慢，出现药物蓄积现象，造成不良反应甚至毒性积累的现象。

CYP3A4酶占肝内CYP酶总量的近30%，含量最高，且约有50%的药物代谢需要CYP3A4酶的参与。因此，CYP3A4酶活性的变化对一大部分药物的代谢具有重要的影响，如大环内酯类抗生素、咪唑类抗真菌药物等。但CYP3A4酶活性易受到底物、抑制剂、诱导剂及基因多态性的影响。此外，葡萄柚汁、木质素类及黄酮类化合物也是CYP3A4酶活性的重要影响因素。EGCG能够抑制CYP3A4酶活性，经CYP3A4代谢的药物会与EGCG发生相互作用，进而对药物疗效产生影响。此外，EGCG对CYP3A4酶的抑制作用受培养时间影响较大，提示在临床用药中应将用药时间作为一个重要影响因素。CYP1A2酶虽仅参与约4%药物的代谢，但其在药物和前致癌物代谢及药物与前致癌物质活化过程中均发挥重要作用。研究结果表明，EGCG对于CYP1A2酶具有竞争性抑制作用，因此，对于经CYP1A2酶代谢的药物，在临床应用中要注意茶类的饮用，预防与EGCG发生不良相互作用。

之前的研究发现，EGCG的血浆浓度随摄入浓度的升高而升高，525 mg EGCG在健康人体内的最大血浆浓度为4.4 μmol/L[28-30]，1 200 mg EGCG的最大血浆浓度约为7.4 μmol/L，接近于EGCG对CYP1A2酶抑制作用的IC50值及CYP3A4的Ki值[31-34]。因此，大量摄入绿茶会增加EGCG的血浆浓度，进而影响其他药物的药效和代谢的风险。

EGCG是茶饮中含量较高的儿茶素类物质，也是临床用于心脑血管及免疫系统疾病防治的常用药。本研究通过EGCG对人肝微粒体中CYP450酶各亚型活性的影响，为EGCG临床合理使用及临床药物治疗中茶叶对药效以及代谢的影响提供了一定的依据。