六斑刺鲀仔稚鱼发育过程中消化酶和非特异性免疫因子的活性变化

苏志星，岳彦峰，施兆鸿，彭士明，夏连军

（中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090）

海水鱼类仔稚鱼发育过程中较弱的消化酶活性是导致苗种培育过程中出现高死亡率的主要原因之一［1］。鱼类消化酶可将大分子营养物质分解为小分子，以利于其被各个组织、器官所吸收，为鱼类的运动、生长和繁殖等活动提供能量［2］。因此，消化酶活性的高低是衡量仔稚鱼营养状况好坏的重要指标［3-4］。目前国内外已有很多关于仔稚鱼期消化酶活性变化的研究，例如匙吻鲟（Polyodon spathula）［4］、黄鳍金枪鱼（Thunnus albacores）［5］、条石鲷（Oplegnathus fasciatus）［6］、牙鲆 （Paralichthys olivaceus）［7］和大黄鱼（Pseudosciaena crocea）［8］等，这些研究有助于探明不同发育阶段仔稚鱼的消化酶活性变化和营养需求。鱼类免疫能力易受外界环境的影响［9-10］，仔稚鱼开口摄食时易被致病菌感染，水体中致病菌的入侵是导致仔稚鱼发育过程中出现高死亡率的另一主要因素［11］。鱼类的免疫系统是防御外源致病菌攻击的重要防线，主要包括非特异性免疫和特异性免疫。鱼的个体大小是特异性免疫产生的最关键因素［12］，仔稚鱼期由于个体较小，免疫系统功能发育不完全，因此主要依赖自身的非特异性免疫来维持机体的健康生长［13］，所以，研究仔稚鱼发育过程中非特异性免疫指标的变化对苗种的健康养殖具有重要指导意义。

六斑刺鲀（Diodon holocanthus）隶属于鲀形目（Tetraodontiformes），二齿鲀科（Diodontidae），刺鲀属，热带海洋性底层鱼类，仔、稚鱼时期随着大洋漂游生活，成鱼则栖息于岩礁区之浅水域，不善游泳，行动缓慢，主要以贝类、棘皮动物及螃蟹等无脊椎动物为食［14］。六斑刺鲀肉质鲜美，鱼皮富含丰富的胶原蛋白，具有较高的食用、药用及观赏价值，深受消费者欢迎。六斑刺鲀资源渔获量具有明显的季节性特征，总体渔获量不高，目前市场销售的六斑刺鲀都是野生捕捞，市场供不应求［15］，因此，近年来其资源量呈锐减趋势。国内外对六斑刺鲀研究较少，关于仔稚鱼发育过程消化酶活性和非特异性免疫活性变化的研究迄今未见。本研究旨在通过探究六斑刺鲀仔稚鱼生长及不同发育阶段消化酶活性和非特异性免疫指标的变化，为六斑刺鲀全人工繁育的苗种培育阶段饵料选择和健康养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用六斑刺鲀仔稚鱼来自于东海水产研究所海南琼海研究中心。六斑刺鲀受精卵经孵化后获得初孵仔鱼，并在室内水泥池中进行苗种培育，仔稚鱼培育期间，盐度30.0～32.0，温度29.0～31.0℃（用加热棒进行控制），pH 7.8～8.2，溶氧保持＞5 mg·L-1。苗种培育过程中饵料投喂组合如下：初孵仔鱼前3 d投喂经营养强化后的轮虫和卤虫无节幼体；第5天时，改投1 mm以下小规格的桡足类和卤虫无节幼体；第10天时，投喂1 mm以上大规格的桡足类（或者大型枝角类，例如蒙古裸腹溞（Moina Mongolica）以及营养强化后的丰年虫（Artemia salina）；第15天左右，初孵仔鱼发育至稚鱼期，此时可投喂凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的无节幼体以及2 mm左右的丰年虫；第20天时，可投喂5 mm以上的丰年虫以及10 mm以下的凡纳滨对虾苗种；第35天左右，发育至幼鱼期，可适量投喂凡纳滨对虾肉糜和颗粒饲料。

苗种培养期间每天取样观察仔稚鱼的生长发育，分别采集初孵仔鱼（孵化当天，计为第1天）以及孵化后第5、10、15、20、25、30、35、40天的样本，1～25 d样品的采集量大约为1.5 mL离心管的2／3体积，25 d后每批采集20尾左右。采样时间设定为投饵前，采集的样品用蒸馏水漂洗干净，吸取多余水分后，立即放入-80℃冰箱冷冻保存待测，同时从培育池中另取样测定苗种全长。

1.2 样品分析

1～25 d的鱼苗整体匀浆，25 d以后的鱼苗剪取腹部。以4℃冰冻重蒸水用玻璃匀浆器匀浆，取部分匀浆液直接测定脂肪酶的活力，剩余部分置于冷冻离心机中，在4℃、10 000 r·min-1离心30 min后，取上清液用于各种消化酶的活力测定。

淀粉酶（amylase）活性定义为在37℃下，每毫升酶液30 min内完全水解10 mg淀粉为一个淀粉酶活力单位U·mg-1。

胃蛋白酶（pepsin）活性定义为每毫克组织蛋白在37℃、pH 3.8条件下每分钟分解蛋白生成1 g氨基酸相当于一个酶活力单位U·mg-1。

胰蛋白酶（trypsin）活性定义为在37℃、pH 8.0条件下每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003即为一个酶活力单位U·mg-1。

脂肪酶（lipase）活性采用南京建成试剂盒检测，定义为在37℃条件下，每毫升酶液在反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 mmol底物为一个酶活力单位U·mg-1。

免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）采用免疫比色法进行测定，所用试剂盒采购于南京建成生物工程研究所，检测方法参照试剂盒说明书。

溶菌酶（lysozyme，LZM）活性检测采用浊度比色法，LZM活力的测定结果表示为U·mg-1，每个活力单位（U）定义为每毫克可溶蛋白每分钟使吸光值降低0.001的倍数。

1.3 数据分析

实验数据采用平均值±标准差（mean±SD）表示，并用SPSS13.0统计软件对结果数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 六斑刺鲀仔稚鱼生长变化

经过40 d的培育，六斑刺鲀的全长变化如图1所示。体长由1 d的2.23 mm增长到40 d的23.47 mm，在1～15 d发育过程中鱼的全长增长速度相对比较平缓，无显著性变化（P＞0.05），而20～40 d过程中全长的增长速度明显加快，全长也发生显著性变化（P＜0.05）。在40 d实验过程中，日龄和全长呈指数相关，拟合的全长增长方程为y=1.900 5e0.2683x（R2=0.980 7）。

图1 六斑刺鲀发育过程中全长与日龄的关系Fig.1 Relation between total length and daily age of Diodon holocanthus larvae

2.2 六斑刺鲀仔稚鱼消化酶活性变化

六斑刺鲀仔稚鱼发育过程中各种消化酶活性变化如图2所示。由图2-a可知，在40 d的生长过程中，仔稚鱼淀粉酶活性呈现明显的先升高后降低再升高的变化趋势；5～20 d仔鱼淀粉酶活性极显著上升（P＜0.01），并在20 d时到达最高，20～30 d时又剧烈的下降（P＜0.01），而在30 d后酶活性又缓慢升高。胃蛋白酶活性变化如图2-b所示，在40 d的发育过程中，胃蛋白酶活性呈现出明显的先升高后降低的变化趋势；1～15 d胃蛋白酶活性极显著上升（P＜0.01），并在15 d时达到最大值，而15～25 d活性又明显下降（P＜0.01），25～40 d酶活性变化趋于稳定且与1～5 d仔鱼间无显著性差异（P＞0.05）。由图2-c可知，胰蛋白酶也呈现先升高后降低再升高的变化趋势，但30 d后增长幅度比淀粉酶更明显；1～10 d仔鱼胰蛋白酶活性出现极显著上升（P＜0.01），并在10 d时达到最大值，10～20 d过程中酶活性又极显著降低（P＜0.01），20～30 d变化不明显（P＞0.05），30～40 d又呈现极显著上升趋势（P＜0.01）。脂肪酶活性变化如图2-d所示，1～5 d仔鱼酶活性显著下降（P＜0.05）。5～10 d又极显著升高（P＜0.01），并在10 d达到最大，15～20 d酶活性又极显著下降（P＜0.01），并在20 d时到达最小值，20～40 d酶活性有轻微波动，但总体变化并不明显（P＞0.05）。

2.3 六斑刺鲀仔稚鱼非特异性免疫指标活性变化

六斑刺鲀仔稚鱼发育过程中非特异性免疫指标活性变化如图3所示。由图3-a可知，仔稚鱼IgM活性呈现先升高后降低的变化趋势，1～10 d活性极显著升高（P＜0.01），并在10 d时达到整个发育过程的最大值，10～25 d活性呈现波动式下降且下降趋势明显（P＜0.01），25～40 d酶活性变化趋于平缓并维持在较低水平，各日龄间无显著差异（P＞0.05）。如图3-b所示，仔稚鱼LZM活性和IgM呈现相似的变化趋势，1～5 d酶活性极显著上升（P＜0.01），并在5 d时达到最高值，10～40 d酶活性出现缓慢下降趋势，且各日龄间变化不明显（P＞0.05）。

3 讨论

图2 六斑刺鲀发育过程中各种消化酶活性变化Fig.2 Changes of digestive enzyme activities in Diodon holocanthus larvae at different developmental stages

图3 六斑刺鲀仔稚鱼发育过程中非特异性免疫指标活性变化Fig.3 Changes of non-specific immune indexes in Diodon holocanthus larvae at different developmental stages

消化酶是由消化系统分泌的具有催化食物水解功能的蛋白质，能够把大分子物质（脂质、蛋白质和淀粉等）水解为小分子（脂肪酸、氨基酸和单糖等）以便于机体的运输和吸收利用［16-17］。鱼类消化酶的分泌受到消化器官发育、营养成分需求以及自身生活习性变化等因素的影响，在生长发育的不同阶段也存在一定差异。鱼类早期发育过程中消化酶的种类、活性和特性能初步反映鱼体消化吸收能力的强弱，进而反映出机体生长和生存状态［18-19］。大量研究［20-21］表明，鱼类发育过程中消化酶活性变化主要受到不同生长期饵料需求转变和消化器官发育程度的影响，其中仔稚鱼由内源性营养转为外源性营养以及仔鱼转变为稚鱼是消化酶活性发生量变的两个重要时期。大多数海水浮性卵鱼类孵化时消化系统还没有分化，但在六斑刺鲀（典型的浮性卵海水鱼类）初孵仔鱼中就可以检测到淀粉酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和脂肪酶活性，表明六斑刺鲀消化酶的活性和种类来自于卵子本身，并受到遗传基因的调控，而不受外源饵料诱导。

3.1 六斑刺鲀仔稚鱼淀粉酶活性变化

鱼类发育的各个阶段淀粉酶活性存在较大差异。本研究中，六斑刺鲀仔稚鱼开口前就具备较低的淀粉酶活性，表明初孵仔鱼已经具备消化碳水化合物的能力。匙吻鲟［4］、日本黄姑鱼（Nibea japonica）［18］、金头鲷（Sparus aurata）［22］等仔鱼在开口前也具有较低的淀粉酶活性，这与六斑刺鲀极为相似；而菊黄东方鲀（Takifugu flavidus）［23］、塞内加尔鳎（Solea senegalensis）［24］等初孵仔鱼的淀粉酶活性较高，造成这种差异的原因可能与鱼的种类、食性以及卵黄中糖原含量不同有关［2，25］。外源糖类可刺激鱼体淀粉酶的表达，CAHU和INFANTE［26］发现食物中12%的淀粉含量可以显著提高舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）淀粉酶活性。六斑刺鲀仔鱼淀粉酶活性在5 d后显著上升，表明此时是仔鱼从内源营养向外源营养转化的关键期，酶活性的升高可能是受到轮虫和卤虫无节幼体中的碳水化合物（如淀粉）的刺激，但5～20 d仔稚鱼的全长变化并不显著，这可能是由于摄取的物质和能量更多地用于器官发育和组织变态，而仔鱼期较弱的游泳能力也会导致摄食活饵时消耗大量能量。此外，活饵料中的淀粉酶对鱼体淀粉酶全活力的贡献也可能是六斑刺鲀仔稚鱼淀粉酶活性增加的原因之一［27］。20 d后，六斑刺鲀仔稚鱼淀粉酶活性显著下降并在30 d时达到最低，之后维持稳定水平。此时仔稚鱼消化系统基本发育完善，对蛋白质和脂质利用率上升而对糖类的利用率下降，同时这种食物需求转变过程中的不适应也会导致淀粉酶分泌系统功能减弱［28-31］。20 d后仔稚鱼进入快速生长期，全长变化显著，虽然此时淀粉酶活性下降，但依然发挥重要作用。淀粉酶变化趋势表明，仔稚鱼前期淀粉酶水解的所得能量不用于机体的生长，而主要用于维持鱼体生存和器官发育。相似的结果在大泷六线鱼（Hexagrammos otakii）［2］、日本鬼鲉（Inimicus japonicus）［32］、欧 洲 鲈（Dicentrarchus labrax）［33］等肉食性海水鱼类中都有过报道。因此可以考虑在1～20 d期间投喂高碳水化合物含量的饵料，而在20～40 d期间投喂低碳水化合物含量的饵料。

3.2 六斑刺鲀仔稚鱼胃蛋白酶活性变化

鱼的胃是胃蛋白酶的主要分泌器官，胃的分化和功能的完善对蛋白质的消化效率以及机体的营养状况具有重要影响［24］。胃在完全形成之前胃酸分泌较弱，胃蛋白酶中碱性蛋白酶活性高，胃消化功能发育完善后，胃蛋白酶中的酸性蛋白活性上升而碱性蛋白活性下降［3，34］。本研究结果显示，六斑刺鲀生长发育早期就可以检测到胃蛋白酶，但活性较低，这与其消化系统的发育相一致。随着日龄的增加，六斑刺鲀仔稚鱼胃蛋白酶活性迅速升高，在大泷六线鱼［2］、长嘴硬鳞鱼（Atractosteus tristoechus）［3］、菊黄东方鲀［23］、尖吻鲈（Lates calcarifer）［34］等仔稚鱼的研究中也得到相似的结果。六斑刺鲀仔鱼在2 d时即可开口摄食，虽然此时的胃蛋白酶活性较低，但轮虫和卤虫等活体饵料中的外源消化酶可帮助消化部分蛋白质［2，35］，蛋白质总体利用率不高。随着仔鱼的生长和胃的不断发育，饵料摄入量逐渐增多，诱导胃蛋白酶基因的表达［2］，胃蛋白酶活性显著增加，并在15 d时达到最大，蛋白质利用率的显著上升也为之后鱼体的快速生长积累大量物质和能量，同时表明仔稚鱼的胃器官可能在15 d或更早就已形成。15～25 d时，随着稚鱼肠道、肝胰脏等消化器官的发育完善，胃蛋白酶功能被部分替代，导致胃蛋白酶活性下降，并一直维持在较低水平。由此可推测，六斑刺鲀胃蛋白酶活性主要受到鱼胃发育程度的影响，而饵料的不断摄入可一定程度上刺激鱼胃的快速发育。

3.3 六斑刺鲀仔稚鱼胰蛋白酶活性变化

胰蛋白酶属于碱性蛋白，在鱼类早期发育过程中对蛋白质的消化起主要作用［36］。本研究中，六斑刺鲀仔稚鱼发育早期就可检测到胰蛋白酶活性，这与大泷六线鱼［2］、细点牙鲷（Dentex dentex）［20］、梭鱼（Liza haematocheila）［25］、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）［37］等研究结果相似。胰蛋白酶对卵黄蛋白的消化具有重要作用，在1～10 d，胰蛋白酶活性显著上升并在10 d时达到最大值，表明在六斑刺鲀仔鱼发育早期，较高的胰蛋白酶活性可以弥补胃功能的缺失或不足，特别在5～10 d时，酶活性增加趋势更为明显，这可能是受到外源食物的刺激，加速了卵黄蛋白的吸收完毕，从而为后续完全外源性营养阶段时自身消化能力的提升做准备［37-38］。卵黄吸收完毕后，仔稚鱼一般会经历短暂的饥饿期，胰蛋白酶活性有所降低［2］。此外，随着仔稚鱼胃消化功能逐步发育成熟，胃的酸性消化在蛋白质的吸收中逐渐发挥作用［3］，胃蛋白酶的分泌对胰蛋白酶基因的表达起到一定的抑制作用。在25～40 d，胰蛋白酶活性又显著上升并维持在较高水平，说明胃的消化功能成熟后，胰蛋白酶在六斑刺鲀仔稚鱼的蛋白质消化中仍发挥着重要作用。总体上，胰蛋白酶活性呈现上升趋势，蛋白质的消化吸收效率也随之增加，加速了鱼体生长和发育。

3.4 六斑刺鲀仔稚鱼脂肪酶活性变化

脂肪酶主要是由鱼类的肝胰脏分泌的，几乎存在于鱼类所有的消化器官中，在海水仔稚鱼的消化生理中占据重要地位［2，39］。饲料中脂肪的直接吸收、过量碳水化合物和蛋白质在肝脏中的转化是鱼类脂肪的重要来源［40］。不同鱼类仔稚鱼的脂肪酶出现时间不同，本研究中，六斑刺鲀初孵仔鱼就可检测到较高的脂肪酶活性，这与匙吻鲟［4］、日本黄姑鱼［18］、黄条鰤（Seriola aureovittata）［40］等研究结果相似。1～5 d六斑刺鲀仔稚鱼脂肪酶活性显著降低，5～15 d酶活性显著增加，15～40 d又明显下降并最终维持在较低水平，这种变化趋势表明六斑刺鲀仔稚鱼的发育伴随着脂肪酶活性的阶段性下降。有研究［27，41］表明，仔稚鱼发育早期体内存在两种类型的脂肪酶，即磷脂酶A2和脂酶，这两种酶在一定条件下可以相互转化。磷脂酶A2的活性可被磷脂激活，初孵仔鱼的卵黄囊中富含磷脂，这导致六斑刺鲀仔稚鱼发育初期脂肪酶活性较高，此时的脂肪酶主要是磷脂酶A2。一般情况下，较高的酶活性可加快能量积累，为仔鱼由内源性营养向外源性营养转化时的游泳和摄食行为的能量消耗做准备。1～5 d脂肪酶活性降低，此时仔鱼已开口摄食，淀粉酶活性也较低，鱼体主要通过消耗卵黄囊或活饵中的蛋白质来提供能量需求（图2-b，c），可推测蛋白质在六斑仔鱼发育早期具有重要作用。因此，六斑刺鲀仔稚鱼发育早期应提供蛋白质含量高的饵料。脂酶活性主要受到饵料中三酸甘油酯的影响，随着仔稚鱼卵黄囊的消耗以及外源活性饵料的摄入，脂酶活性被饵料中的三酸甘油酯激活。5～10 d六斑刺鲀仔稚鱼脂肪酶活性显著增加，这可能与胰腺外分泌功能的成熟以及活体饵料中脂肪含量变化有关［3，27］，然而其他各种消化酶活性也很高，说明这段时间能量需求大，但鱼体全长变化并不显著（图1），表明大部分能量用于摄食活动和器官发育，并为仔鱼向稚鱼的转变提供物质储备。15 d后脂肪酶活性降低并一直维持在较低水平，这受到稚鱼的生理需求变化、饵料种类和摄入量的影响。

3.5 六斑刺鲀仔稚鱼非特异性免疫指标活性变化

鱼类作为变温、低等脊椎动物，具有特异与非特异性两大免疫系统［42］。鱼类系统发育学认为非特异性免疫要早于特异性免疫，因为特异性免疫的产生可能主要取决于鱼的大小而非年龄［12］。鱼类早期发育时个体较小，特异性免疫器官发育不完全，因此机体主要依赖非特异性免疫和母源性免疫来抵御外源致病菌的入侵［43］。LZM和IgM作为两种最常见的生物标志物，是机体非特异性防御机制的第一道防线，其活性大小直接反映出免疫力的强弱［44-45］。本研究中，在1～10 d六斑刺鲀仔稚鱼LZM活性显著增加，随后缓慢下降并趋于稳定，IgM活性在1～5 d上升显著，之后逐渐降低并维持在较低水平，总体上，两者都呈现出先上升后下降的变化趋势。3 d后的仔鱼已开始摄食，仔鱼处于内源性营养向外源性营养转化的混合营养期，营养物质既可以从卵黄中摄取又可以从外源饵料中摄取，这个阶段极易感染致病菌，非特异性免疫因子的高活性可有效增强机体免疫力。此外，外源生物饵料的摄入，也会一定程度地刺激LZM和IgM相关基因的表达［46］。而LZM和IgM活性的逐渐降低，说明仔稚鱼对外部环境慢慢适应，达到免疫平衡。最终，随着仔稚鱼的生长，特异性免疫器官也逐渐成熟，特异性免疫因子陆续表达，部分代替或抑制非特异免疫因子的作用，最终维持平衡状态。

4 小结

综上，在六斑刺鲀仔稚鱼发育过程中，消化酶的活性随着仔稚鱼的生长发育发生显著变化。六斑刺鲀为杂食性鱼类，在发育早期对蛋白质的利用能力较强，随着消化系统的发育，对糖类和脂肪的利用也有所提高。目前虽然对一些酶的变化机制还不是十分清楚，但了解酶活性的变化规律可为苗种培育过程中饵料投喂的调整提供理论基础。此外，仔稚鱼发育过程中非特异性免疫在抵御致病菌入侵时也发挥重要作用，特别在初孵仔鱼开口前后非特异性免疫指标活性显著升高，可有效提高仔稚鱼开口期的成活率。